蛋白质的分离纯化
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。
对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。
蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。
蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。除去的方法有：
核酸沉淀法
该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。
醋酸铅沉淀法
利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。
调pH值或加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的PH下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。
选择性变性法
利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白。例如胰蛋白酶及细胞色素C等少数特别稳定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白均变性而沉淀，而胰蛋白酶和细胞色素C则仍留在溶液中。
透析法
小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。
利用溶解度不同的纯化方法
原理
盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度10～1间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I2～10）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐析时蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示：
S
1g-----=-ks×l
So
式中S0为蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S为蛋白质在溶液的离子强度为I时的溶解度，KS为盐析常数。离子强度可用下式计算。： 1
I=---∑miZi2
2
式中mi为溶液中各种离子摩尔浓度，Zi为各种离子的价数。①式中当温度一定时，S0对于某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数，故（1）式也改定为：
lgS=β-ks×I
式中β=lgS0，也为一常数，β值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的PH和温度有关。ks值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关，也与蛋白质结构有关。一般来说，蛋白质在某一盐液中ks愈大，盐析效果愈好。蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子，常需用要较高的I值才能从溶液中析出。根据（3）式分离纯化蛋白质，可在一定的PH和温度下改变盐的I值，称为“ks分段盐析法”，提纯前期常应用此法；也可在一定I值下改变PH及温度，称为“β分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。
盐的选择
如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱满和溶解度为4.1mol,即767g/l;0℃时饱满和溶解度为3.9mol,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。
硫酸铵浓溶液的PH常在4.5～5.5之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH值往往降至4.5以下,当用其他PH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.
硫酸铵饱和度计算及加入方式
在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再生0℃或25℃下平衡1～2天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算：
S2 - S1
V=V0--------------
1 - S2
式中V及V0分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积，S2和S1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%，可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：
G（S2 - S1）
X = ----------------
1-AS2
式中X是将1I饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量（g），G及A为常数，与温度有关。G在0℃时为707，20℃时为756，A在0℃时为0.27，20℃时为0.29。在室温及0℃时所需硫酸铵饱和度可查表。第3种调整饱和度的方法是将盐析的样品液装于透析袋内对饱和硫酸铵进行透析，此法浓度变化较连续，不会出现盐的局部过高现象，但盐析时测定盐的饱和度手续较繁，运用较少。
确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法
将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。
盐析时注意的几个问题
盐的饱和度 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第2种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至28～33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至33～50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时清蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液中分离得到9种以上蛋白质及酶。
PH值 pH值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。
蛋白质浓度 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清球蛋白的浓度从0.5%增至3.0%时,需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2次为40%至60%.蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。
温度 由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。
脱盐 蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。脱盐方法最常用的是透析法。透析法所需时间较长，常在低温下进行并加入防腐剂避免微生物污染。透析使用前必须处理，方法是将透析袋置于0.5mol/LEDTA溶液中煮0.5h,弃去溶液,用蒸镏水洗净,置50%甘油中保存备用。
也可用分子筛层析，常用SephadexG-25柱层析法，上样不要超过床体积的20%。
此外，有些金属离子能和蛋白质形成较为专一的结合而使蛋白质沉淀。这虽不是典型的盐析，但在制备蛋白质中有许多成功的例子。锌离子在特定pH下与胰岛素结合形成沉淀就是这种例子。
蛋白质从悬浮液中沉淀出来的速度极慢，必须用强力离心来促进这个过程。