阿尔茨海默症: 关于 "β-淀粉样蛋白" 的 7 大常见检测！

Section.03

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

Aβ 寡聚体是在 Aβ 聚集过程中早期的致病分子形式和神经毒性物质。由于 Aβ 寡聚体异质且瞬时存在，光诱导未修饰蛋白质交联 (PICUP) 反应可有效的交联得到 Aβ40/Aβ42 寡聚物，再通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 量化其相对丰度。Aβ40 主要通过二聚体至四聚体进行寡聚化，而 Aβ42 主要通过五聚体和六聚体进行寡聚化^[2][3]，且随着寡聚体增加而表现出强度降低 (图 2a)。鉴于 SDS 影响 Aβ 的寡聚化状态，电喷雾电离质谱法 (ESI-IM-MS) 进一步准确表征低丰度 Aβ 寡聚体的分布 (图 2b)^[4]。

画板 55.png

图 2. Aβ42 主要通过五聚体和六聚体进行寡聚化^[4]。

a. 通过 SDS-PAGE 分析表征 LMW 和 LMW_CL Aβ40 和 Aβ42 低聚物分布。b. LMW Aβ42 的 ESI-IM-MS 谱图。(M = 单体，D = 二聚体，Tr = 三聚体，Te = 四聚体，P = 五聚体，Hex/Hx = 六聚体。)

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PICUP基本原理：利用光能作为催化剂，驱动特定的化学反应，从而在无需修饰蛋白质的情况下实现交联。

SDS-PAGE基本原理：在 SDS-PAGE 中，加入十二烷基硫酸钠（SDS）和强还原剂，SDS 破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用，使其构象改变，而还原剂打开蛋白质内的二硫键，使其分解为亚基。根据待测样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。

ESI-IM-MS基本原理：在毛细管的出口处施加高电压，产生的高电场将从毛细管流出的液体雾化成微小的带电液滴。随着溶剂的蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增加，最后液滴分裂成一个或多个带电离子，从而使分析物以单电荷或多电荷的形式进入气相变成气相离子，再检测产生高电荷离子的质量电荷比。

Section.04

免疫组化

AD 的主要特征是老年斑 (SP) 和神经原纤维缠结 (NFT) 在脆弱的大脑区域沉积。SP 在神经元内积累，由聚集的 Aβ40/42 肽组成。用 Aβ42 的 C 端特异性抗体对认知障碍受试者中的脑组织染色，可以清晰的看到 AD 患者早期脑部组织显示出大量的区域特异性神经元内免疫反应性，尤其在海马/内嗅皮层等区域的锥体神经元中 (图 3)^[5]。

图 3. Aβ42 在 AD 患者早期脑部组织中积累^[5]。

a. 神经学正常的 3 岁患者（对照）海马体 CA4 区域的 Aβ42 染色;只能看到微弱的神经元染色。b. 一名患有唐氏综合征的 3 岁儿童的明显 CA4 Aβ42 免疫反应性。c. 79 岁无痴呆患者的 Aβ42 染色表明内嗅皮层的 II 层神经元（箭头）有明显的 Aβ42 细胞内染色。d. 83 岁的认知障碍受试者中，在 Aβ42 (RU) 染色的神经元中明显缺乏核内 Aβ42 染色; e. 72 岁的晚期 AD 受试者的“神经元”形状的老年斑 (SP)（箭头）与更传统的球形 SP 相邻；f. 79 岁认知障碍受试者的 CA1 区域显示神经元内 Aβ42 免疫反应性和明显的神经元外弥漫性斑块样染色 (箭头)。

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IHC 基本原理：融合免疫学原理 (抗原抗体特异性结合) 和组织学技术 (组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色，来对组织 (细胞) 内抗原进行定位、定性及定量的研究 (主要是定位)。

Section.05

质谱分析

Aβ40 在 AD 患者体内的丰度是 Aβ42 的 10 倍，但 Aβ42 的神经毒性比 Aβ40 强。用纳米 ESI 离子迁移质谱仪检测 Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物（用 FMOC 化学方法合成 Aβ40 和 Aβ42）发现，纯 Aβ42 的寡聚化速度比 Aβ40 快得多，导致 Aβ42 快速耗尽 (图 4a)^[6]。CSF 中 Aβ42 与 Aβ40 的比率有助于评估 AD，但定量受到包括分析前分析物损失等因素的限制。高通量 LCMS/MS 技术可以限制分析物损失，对临床的 CSF 标本分析显示 AD 和轻度认知障碍 (MCI) 患者中 Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 浓度都降低^[15]，进一步证实 Aβ42 的寡聚化是 AD 的重要原因 (图 4b)。

图 4. Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 浓度在 AD 和 MCI 患者中都降低^[7]。

a. Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物的负离子质谱^[14]。b. Aβ42/Aβ40（上）和 Aβ42（下）在 AD、MCI、DLB/AD、健康对照、非 AD 痴呆和伴或不伴 AD 的 DLB 中的分布 (MCI：轻度认知障碍；DLB：路易体痴呆)。

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LCMS/MS 基本原理：样品通过液相色谱分离后的各个组分依次进入质谱检测器，各组分在离子源被电离，产生带有一定电荷、质量数不同的离子。不同离子在电磁场中的运动行为不同，采用质量分析器按不同质荷比（m/z）把离子分开，得到依质荷比顺序排列的质谱图。

Section.06

免疫荧光

神经元内 Aβ42 在 AD 或 DS 切片中具有胞质颗粒免疫反应性^[8]，主要定位于神经元的突触前，尤其是突触后隔室内的多泡体中积累，但由于很快被大脑中的小胶质细胞清除，因此不容易观察到。在唐氏综合症 (DS) 星形胶质细胞中使用针对 Aβ42 C 端产生的单克隆抗体进行了免疫荧光显微镜观察，显示 DS 星形胶质细胞中 Aβ42 呈囊泡状分布 (图 5a)^[9]。细胞内 Aβ42 能直接激活 p53 启动子，导致 p53 依赖性细胞凋亡。此外，氧化 DNA 损伤诱导了豚鼠原代神经元中 Aβ42 的核定位和 p53 mRNA 升高。氧化 DNA 损伤可能诱导 Aβ42 在胞质溶胶中积累，然后依次在激活 p53 级联反应的细胞核中积累 (图 5b) ^[10]。

图 5. Aβ42 呈囊泡状分布，且氧化 DNA 损伤诱导了 Aβ42 的核定位^[9][10]。

a. 正常 (NL) 和 DS 星形胶质细胞中对 Aβ42 进行免疫荧光检测 (上)^[9]。b. H₂O₂ 诱导胚胎豚鼠脑细胞中 Aβ42 (绿色) 和 p53 (红色) 的双重免疫染色 (下)^[10]。

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IF 基本原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原 (或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及定量 (荧光面积或平均荧光强度等)。

Section.07

流式细胞术

Aβ 肽的异常神经元积累会影响突触传递并导致 AD 大脑的神经退化。其中 Aβ40 和 Aβ42 能扰乱神经元细胞的内吞作用和细胞内运输。利用分析流式细胞术用 Aβ42 特异性抗体检测 AD 患者额叶皮层和纹状体中发生的突触变化，发现严重 AD 患者大脑皮层中 Aβ42 阳性突触体的数量增加，并在人皮质突触体中积累 (图 6a-c)^[11^]。此外，Aβ40 通过减少 PC12 细胞对 F-Aβ42 (荧光素标记的 Aβ42) 的摄取来减少 Aβ42 在神经元内积累和溶酶体定位 (图 6d-f)^[12]。

图 6. AD 患者大脑皮层中 Aβ42 阳性突触体的数量增加^[11][12]。

(a-c) 用抗 Aβ42 抗体检测 AD 患者皮质突触体中 NFT 分布的 Braak 阶段系统，神经炎斑块密度的 CERAD 评分和 Aβ42 斑块分布的 Thal 期^[11]。（d）Aβ40 抑制分化的 PC12 细胞中对 F-Aβ42 的摄取细胞内荧光的流式细胞术直方图显示 Aβ40 预处理细胞中 F-Aβ42 摄取的抑制；（e）F-Aβ40 的摄取不受 Aβ42 预处理细胞的影响。（f）细胞内荧光的几何平均值^[12]。

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FC基本原理：利用激光激发带有荧光标记的微粒，检测其散射光信号和荧光信号，从而反应微粒的各个参数，并将特定性状的微粒分选出来。

Section.08

表面等离子体共振

在正常生理条件下， Aβ42 和 Aβ40 肽以 1:9 的比例共存于大脑中。而在家族性 AD 患者的大脑中，该比率通常转变为 Aβ42 的较高百分比，导致突触毒性增加。据报道，尽管这两种肽的化学性质非常相似， Aβ42:Aβ40 比率的微小变化会极大地影响神经毒性寡聚体的形成。利用 SPR 技术表征了不同生物素化的 Aβ42:Aβ40 比率的开始和结束状态，并证实了 Aβ42 和 Aβ40 可以直接相互作用，并且它们相互影响各自的聚集行为 (图 7)^[13]。

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图 7. Aβ42 和 Aβ40 直接相互作用^[13]。

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SPR 基本原理：指金属表面的电子以及周围介质中的电子，以特殊频率的共振而产生的一种特殊的电磁波，可以检测抗原与抗体、DNA 与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用。

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参考文献：

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