肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏的纯化与使用
心肌肌球蛋白是从牛心组织中纯化的（1, 2）。完整的肌球蛋白包括其必需轻链（ELC）和调节轻链（RLC）被纯化，详见图1和图2。随后，肌球蛋白通过α-胰蛋白酶消化，释放出可溶性的亚片段-1（S1）结构域，并通过离心分离（3）。纯化的肌球蛋白S1片段已在F-肌动蛋白激活的ATP酶活性测定中被证实具有生物学活性（见生物学活性测定）。牛心肌肌球蛋白S1片段以白色冻干粉形式提供。
图1. 肌球蛋白蛋白及其亚片段的示意图
图例：肌球蛋白是一种由两条重链和两条轻链组成的六聚体蛋白。在镁存在的情况下，肌球蛋白可以通过α-胰蛋白酶被蛋白酶解为重链肌球蛋白（HMM）和轻链肌球蛋白（LMM）。然而，在EDTA存在的情况下，α-胰蛋白酶会产生可溶性的肌球蛋白S1片段（3）。
图2. 完整肌球蛋白和S1肌球蛋白
将20微克的完整牛心肌球蛋白（泳道A）和相应的S1肌球蛋白（泳道B）通过4-20% SDS-PAGE凝胶电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。箭头表示肌球蛋白重链（约200 kDa），箭头表示调节轻链（约20 kDa）和两种必需轻链同工型（约25 kDa和21 kDa）。蛋白定量采用Precision Red™蛋白测定试剂（货号：ADV02）进行。Mark12分子量标记来自Invitrogen。
艾美捷肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏（#CS-MYS03）用途：
1. 测量钙激活的肌球蛋白ATP酶活性，当其与细丝结合时。
2. 识别/表征影响TT复合物调节和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白质或小分子。
3. 识别/表征影响肌球蛋白/F-肌动蛋白相互作用的蛋白质或小分子。
储存与复溶
短暂离心以使产品聚集在管底。用300微升Milli-Q水复溶1毫克的MYS03（10毫克瓶用3毫升）将产生浓度为3.3毫克/毫升的心肌S1肌球蛋白溶液，其缓冲液组成为：20 mM PIPES，pH 7.0，5%（质量/体积）蔗糖和1%（质量/体积）葡聚糖。该蛋白应避免反复冻融。冻干蛋白在4°C干燥条件下（湿度<10%）可稳定保存1年。
纯度
通过扫描密度法对4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上考马斯亮蓝染色的蛋白进行分析，确定用于产生肌球蛋白S1片段的肌球蛋白及其轻链的纯度为90%（见图2）。
生物学活性测定 ：
牛心肌球蛋白S1片段的生物学活性可通过其F-肌动蛋白激活的ATP水解速率来确定。测定方法是先将肌动蛋白聚合形成F-肌动蛋白，然后将心肌原肌球蛋白/原肌钙蛋白复合物（TT复合物）与肌动蛋白丝按化学计量比混合。这会形成类似肌肉纤维细丝的包被丝。肌球蛋白以亚化学计量比加入，并用ATP和钙启动反应。严格的质量控制确保在缺乏钙的情况下，TT复合物完全抑制肌球蛋白ATP酶活性。加入10微摩尔钙后，肌球蛋白ATP酶活性将恢复。钙与原肌钙蛋白C结合，使其从F-肌动蛋白上解离，从而使肌球蛋白能够结合。
试剂
1. 心肌TT复合物（1×1毫克，货号：TT05）
2. 心肌肌球蛋白S1（0.25毫克），货号：MYS03）
3. 心肌肌动蛋白（1毫克，货号：AD99-A）
4. ATP酶活性生化试剂盒（货号：BK051）
5. 100 mM ATP，溶于50 mM Tris-HCl，pH 7.5（100微升）
6. 1 M二硫苏糖醇，溶于水（100微升）
7. PM12反应缓冲液（12 mM PIPES-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl₂）
8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0
肌球蛋白S1片段(心脏),牛心脏文献参考：
1. Pollard, T.D., . 1982. Methods in Cell Biol. 24:333
2. Margossian, S.S., and Lowey, S. 1982. Methods in Enzymology.85:55-71.
3. Weeds, A.G., and Taylor, R.S. 1975. Nature (London) 257:54.
4. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.
https://www.amyjet.com/products/CS-MYS03.shtml
SiR-肌动蛋白试剂盒--立即成像，无需洗涤步骤
SiR-actin 基于硅罗丹明（SiR）荧光团和肌动蛋白结合天然产物雅斯普霉素（jasplakinolide）。SiR-actin 可在活细胞中特异性地标记 F-肌动蛋白，背景低（1）。SiR-actin 的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜技术（STED 和 SIM）兼容。这些特性在一个探针中的独特组合使 SiR-actin 处于卓越的前沿。
艾美捷SiR-肌动蛋白试剂盒（#CY-SC001）物理性质：
- 吸收波长（abs）：652 nm
- 发射波长（Em）：674 nm
- 摩尔吸光系数（ε652 nm）：1.0×105 mol-1·cm-1
- 分子量（MW）：1241.6 g/mol
- 分子式（MF）：C71H88N8O10Si
储存与操作
收到后请将化合物保存在 -20°C 以下。使用无水 DMSO 配制化合物溶液。使用后请将溶液保存在 -20°C 以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO 溶液应特别小心处理，因为 DMSO 已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。
注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-actin 基于肌动蛋白稳定药物雅斯普霉素。因此，它可以改变活细胞中的肌动蛋白动态。尽管在高达 3 µM 的 SiR-actin 浓度下，有丝分裂持续时间保持不变，但在培养的 HeLa 细胞中，超过 100 nM 的浓度会导致细胞增殖指数降低（1）。如果计划进行长期成像实验，且肌动蛋白动态至关重要，我们建议将 SiR-actin 的浓度保持在 100 nM 或以下。对于其他用途，建议使用 1 µM 的 SiR-actin 进行染色。
配制 1 mM 储备液
将 SiR-actin 小瓶中的内容物溶解在 50 µL 无水 DMSO 中，制备 1 mM 储备液。此溶液应保存在 -20°C 或以下。不要将溶液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，此储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要精确测定储备液的浓度，将 1 µL 1 mM 储备液稀释在含有 0.2% SDS 的 99 µL PBS 中。在室温下静置 15 分钟后，测量 652 nm 处的吸光度。使用上述摩尔吸光系数计算浓度。
配制染色液
将 SiR-actin 稀释到所需的浓度，加入细胞培养基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用 1 µM 的浓度，以快速获得强染色效果，然后在后续实验中逐步降低 SiR-actin 的浓度，直至达到最佳染色效果（见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，导致 SiR-actin 染色效果不佳。在染色液中加入 10 µM 的维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常会显著改善染色效果。仅使用新配制的染色液，不要重复使用。
细胞准备与染色
按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系：
细胞成像：
SiR-actin 的成像最好使用标准的 Cy5 设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在 100 nM 或以下，以获得稳定的信号并避免探针对肌动蛋白动态产生干扰（细胞增殖减少）。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。
SiR-肌动蛋白试剂盒文献参考：
1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavičius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)
https://www.amyjet.com/products/CY-SC001.shtml
RhoA Pulldown活化检测试剂盒，简单测定细胞中RhoA的激活
Rho开关通过在活性的GTP结合态和非活性的GDP结合态之间交替来发挥作用。了解调节GTP酶激活/失活的机制显然具有生物学意义，也是当前研究的热点。许多Rho家族效应蛋白能够特异性识别蛋白质的GTP结合形式，这一特性已被实验性地利用来开发一种强大的亲和纯化测定法，用于监测RhoA蛋白的激活。该测定法使用Rho效应蛋白Rhotekin的Rho结合域（RBD）。RBD基序已被证明能特异性结合RhoA的GTP结合形式。Rhotekin的RBD区域对GTPRhoA具有高亲和力，并且Rhotekin的结合会导致GTP水解的固有速率和催化速率显著降低，这使得它成为从细胞裂解液中亲和纯化GTPRhoA的理想工具。本试剂盒提供的RhotekinRBD蛋白包含Rhotekin的789位残基，以GST融合蛋白的形式存在，这使得人们能够利用颜色鲜艳的谷胱甘肽亲和珠子“拉下”RhotekinRBD/RhoGTP复合物。因此，该测定法提供了一种简单的方法来定量检测细胞中RhoA的激活。通过使用特异性针对RhoA的抗体进行Westernblot来确定激活的RhoA的量。
艾美捷RhoA Pulldown活化检测试剂盒（#BK036S）试剂盒内容：
根据测定设置，该试剂盒包含足够进行20次测定的材料，并包括用于阳性和阴性对照的试剂。还有可供进行80次测定的较大版本试剂盒，货号为BK036。包含以下组分：
#RT02：带有颜色的琼脂糖珠子上的GST标签RhotekinRBD蛋白
#ARH03：RhoA特异性单克隆抗体
#RH01：His标签RhoA蛋白
#BS01：GTPγS（非水解性GTP类似物）
GDP
细胞裂解缓冲液
洗涤缓冲液
上样缓冲液
停止缓冲液
货号PIC02：蛋白酶抑制剂混合液
附有详细操作步骤和广泛的故障排除指南的手册
所需设备
SDSPAGE迷你凝胶系统和Westernblot转移装置
实验结果示例：
图1：试剂盒BK036S中颜色鲜艳的谷胱甘肽琼脂糖珠子使其易于使用。
通过在细胞裂解液中加载RhoA蛋白，分别使用GTPγS或GDP来测试RhoA激活测定法。正如预期的那样，加载了GTPγS的RhoA被非常高效地沉淀，而加载了GDP的RhoA沉淀量很少（见图2）。
图2：使用试剂盒BK036S进行RhoA激活测定的结果。激活的Rho通过Westernblot检测，使用试剂盒BK036S进行沉淀。第一泳道显示50纳克重组His标签RhoA标准品（Rec.HisRhoA）。接下来的泳道显示从等量细胞裂解液中沉淀的非活性、GDP加载的RhoA（RhoAGDPPD）或活性、GTPγS加载的RhoA（RhoAGTPPD）。
GLISA 产品
Cdc42 GLISA™ 激活测定试剂盒，比色法（货号：BK127）
Rac1 GLISA™ 激活测定试剂盒，发光法（货号：BK126）
Rac1,2,3 GLISA™ 激活测定试剂盒，比色法（货号：BK125）
RhoA GLISA™ 激活测定试剂盒，比色法（货号：BK124）
RhoA GLISA™ 激活测定试剂盒，发光法（货号：BK121）
相关产品
抗Cdc42单克隆抗体（货号：ACD03）
抗Rac1单克隆抗体（货号：ARC03）
抗RhoA单克隆抗体（货号：ARH03）
https://www.amyjet.com/products/BK036S.shtml
SiR-DNA试剂盒：细胞准备、染色与成像方案
SiR-DNA基于硅罗丹明（SiR）荧光团和DNA小沟结合剂双苯咪唑（Hoechst）。SiR-DNA可在活细胞中特异性地标记DNA，背景低（1）。SiR-DNA的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜技术（STED和SIM）兼容。这些特性在一个探针中的独特组合使SiR-DNA处于卓越的前沿。
艾美捷SiR-DNA试剂盒（#CY-SC007）物理性质：
-吸收波长（Abs）：652nm
-发射波长（Em）：674nm
-最大摩尔吸光系数（εmax）：1.0×10⁵mol⁻¹·cm⁻¹
-分子量（MW）：950.2g/mol
-分子式（MF）：C56H59N9O4Si
储存与操作
收到后请将化合物保存在-20°C以下。使用无水DMSO配制化合物溶液。使用后请将溶液保存在-20°C以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。
标记协议：
注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-DNA基于DNA小沟结合分子双苯咪唑。因此，它可以改变活细胞中的DNA代谢。在高达10µM的SiR-DNA浓度下，有丝分裂持续时间和染色体错误分离保持不变。然而，一项独立研究（1）使用CyclinB1和γH2AX报告基因检测建议，如果计划进行长期（>12小时）成像实验，建议使用250nM或以下浓度的SiR-DNA。对于所有其他用途，建议使用1-3µM的SiR-DNA进行染色。
配制1mM储备液：
将SiR-DNA小瓶中的内容物溶解在50µL无水DMSO中，制备1mM储备液。此溶液应保存在-20°C或以下。不要将溶液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，此储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要精确测定储备液的浓度，将1µL1mM储备液稀释在含有0.2%SDS的99µLPBS中。在室温下静置15分钟后，测量652nm处的吸光度。使用上述摩尔吸光系数计算浓度。
配制染色液：
将SiR-DNA稀释到所需的浓度，加入细胞培养基（例如DMEM+10%胎牛血清）中，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用3µM的浓度，以快速获得强染色效果，然后在后续实验中逐步降低SiR-DNA的浓度，直至达到最佳染色效果（见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，导致SiR-DNA染色效果不佳。在染色液中加入1-10µM的维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常会显著改善染色效果。
细胞准备与染色：
按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5%CO₂的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系：
注意：SiR-DNA可以对用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞进行染色。
细胞成像：
SiR-DNA的成像最好使用标准的Cy5设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在1µM或以下，以获得稳定的信号并避免探针对DNA代谢产生干扰。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。请注意，SiR-DNA可能会被360-390nm的光激发，并由于探针的DNA结合部分的荧光而在大约450nm处产生一些荧光。
SiR-DNA试剂盒文献参考：
1. Sen, Onur, Adrian T. Saurin, and Jonathan MG Higgins.; Scientific reports 8.1 (2018): 7898
https://www.amyjet.com/products/CY-SC007.shtml
Acti-stain555鬼笔环肽--免疫荧光的应用方案
鬼笔环肽是一种来自毒鹅膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能够特异性且高亲和力（解离常数 Kd 为 20 nM）地结合到聚合态肌动蛋白（F-肌动蛋白）上。鬼笔环肽可将肌动蛋白聚合的临界浓度降低至不到 1 µg/ml，从而作为一种聚合增强剂。鬼笔环肽已被标记上一种专有的红色荧光染料（1），使其可用于染色组织培养细胞和组织切片（2，见图 2）以及无细胞体系中的肌动蛋白丝。Acti-stain™ 555 鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝保留了许多未标记肌动蛋白的功能特性，包括它们与肌球蛋白相互作用的能力。
艾美捷Acti-stain555鬼笔环肽（#PHDH1-A）以红色固体形式提供，分子量为 1775。对该化合物进行的吸收光谱和荧光扫描显示，其吸收峰位于 550 nm，荧光峰位于 570 nm（见图 1）。1×工作液的 PHDH1 足够用于染色 300-350 片盖玻片（22×22 mm）上的细胞（见图 2）。
注意：鬼笔环肽有毒，必须小心处理（人类 LD50 = 2 mg/kg）。
图 1：Acti-stain™ 555 的吸收光谱和荧光扫描
图例：标记的鬼笔环肽被稀释到甲醇中，其吸收光谱和激发光谱分别在 250-750 nm 和 550-750 nm 范围内扫描。吸收峰位于 550 nm，荧光位于 570 nm。
图 2：Swiss 3T3 细胞中的肌动蛋白应力纤维
图例：Swiss 3T3 细胞在玻璃盖玻片上生长至半融合状态，并用 Acti-stain™ 555 鬼笔环肽和 DAPI（核染料）按方法描述进行固定和染色。细胞在配备 TRITC 滤光片组（535Ex/585Em 滤光片组）、数字 CCD 相机和 100×物镜的荧光显微镜下观察。注意细胞中遍布的肌动蛋白应力纤维（红色）。
储存与复溶
短暂离心以使产品聚集在管底。用 500 µL 100% 甲醇复溶，制备 14 µM 的溶液。建议将溶液保存在 -20°C 的一个瓶中，可稳定保存 6 个月。冻干产品在 4°C 干燥条件下（湿度<10%）可稳定保存 6 个月。
应用 ：免疫荧光
用于组织培养细胞中肌动蛋白丝荧光染色的方法有多种。固定程序对于获得细胞内 F-肌动蛋白分布的真实表示至关重要。应根据实验要求选择固定方法。用甲醛或戊二醛固定组织培养细胞可获得出色的肌动蛋白丝染色效果和良好的片状伪足保存效果。
试剂
1. Acti-stain™ 555 鬼笔环肽（货号：PHDH1）
2. 在玻璃盖玻片上生长至半融合状态的 Swiss 3T3 细胞
3. 要么从 Cytoskeleton, Inc. 购买 F-肌动蛋白染色试剂盒（货号：BK005），要么准备以下 4-7 项试剂
4. 磷酸盐缓冲液（PBS，20 mM 磷酸钾，pH 7.4，150 mM NaCl）
5. 固定液（PBS 中的 3.7% 甲醛，pH 需调至 7.0）
6. 通透缓冲液（PBS 中的 0.5% Triton X-100）
7. 抗褪色封片介质（Fluka BioChemika，货号：10981）
8. PBS 中的 100 nM DAPI（4’6-二氨基-2-苯基吲哚）
9. 显微镜载玻片（25×75×1 mm）
10. 封片液（透明指甲油）
设备
1. 荧光显微镜，配备用于 Acti-stain™ 555 的 TRITC 激光激发滤光片（535±20 nm）和发射滤光片（585±20 nm），以及用于 DAPI 的激发滤光片（355±20 nm）和发射滤光片（440±20 nm）。
2. 数字 CCD 相机。
Acti-stain555鬼笔环肽文献参考：
1. Wulf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.
2. Kron, S.J. et al. (1991). Meth. Enzmol. 196: 399-416.
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Signal-Seeker 泛素化富集试剂盒(30次检测)-轻松分析关键调控蛋白的修饰
Signal-Seeker™ 产品系列的开发旨在让专业人士和非专业人士都能轻松分析关键调控蛋白的修饰。全面的 Signal-Seeker™ 试剂盒提供了一种亲和珠子系统，用于从任何给定的细胞或组织裂解液中分离和富集修饰蛋白。随后，通过标准的 Western blot 程序，使用针对目标蛋白的一抗来分析富集的蛋白群体。
艾美捷Signal-Seeker 泛素化富集试剂盒(30次检测)（#BK161）用途包括：
研究瞬时调控机制
测量多条信号通路成员蛋白的信号事件
发现目标蛋白的新修饰
洞察调控机制
测量内源性或瞬时表达蛋白的信号事件
实验结果示例：
这些试剂盒有多种应用（见下一部分），这里我们描述了一个关于 Rac1 蛋白的有趣应用：
应用 1：研究高度瞬时的调控事件
Rho 家族蛋白（包括 Rac1）的活性已知部分通过泛素化（也称为泛素化修饰）事件进行调控，这些事件可以通过修饰蛋白的降解和/或定位来调节信号通路（Visvikis, O. 等人，2010. Biol. Cell 102: 377-389；Nethe, M. 和 Hordijik, P. 2010. J. Cell Sci. 123: 4011-4018）。在许多情况下，Rac1 的 GTP 结合活性形式是泛素化的首选底物。例如，研究表明，用细菌毒素 CNF1 处理的细胞会导致 Rac1 的持续激活以及随后的单泛素化和多泛素化（Pop, M. 等人，2004. J. Biol. Chem. 279: 35840-35848）。
使用 Signal-Seeker™ 泛素化检测试剂盒（货号：BK161），我们检测了用 CNF1 毒素（货号：CN04）处理的 3T3 细胞中内源性 Rac1 的泛素化，并发现在 300 µg 的 3T3 细胞裂解液中可以检测到 Rac1 的单泛素化和多泛素化。该试剂盒提供了一种用户友好的工具，用于检测任何目标蛋白的单泛素化和多泛素化。
图 1：Swiss 3T3 细胞预先用 MG-132 处理，然后未处理或用 CNF1（CN04）处理 3 小时，随后用 BlastR 缓冲液裂解。利用 BK161 试剂盒对每种条件的 300 µg 裂解液进行免疫沉淀（IP）。泳道 1：3 µg 未处理裂解液输入；泳道 2：泛素亲和珠子（UBA01）+ 未处理裂解液；泳道 3：UBA01 + CN04 处理的裂解液；泳道 4：泛素对照珠子（CUB02）+ 未处理裂解液；泳道 5：CUB02 + CN04 处理的裂解液。使用抗 Rac1 抗体检测 Rac1 的泛素化。
在这一研究领域可以尝试的其他实验包括：
泛素化酶或去泛素化酶在 Rac1 单泛素化和多泛素化中的药理学研究
在多种不同的生长因子或药物处理下，研究 Rac1 激活与泛素化之间的关系
检测泛素化 Rac1 与效应蛋白的相互作用
检测泛素化 Rac1 与其他 Rac1 调控性翻译后修饰（PTMs）之间的相互作用
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Signal-Seeker™：BlastR™ 快速裂解液制备试剂盒（货号：BLR01）
Signal-Seeker™ 泛素亲和珠子（货号：UBA01B-beads）
Signal-Seeker™：PTMtrue™ 泛素抗体（货号：AUB01）
https://www.amyjet.com/products/BK161.shtml
SPY555-肌动蛋白探针，明亮且无毒，适用于活细胞和固定细胞
SPY555-actin 是一种基于我们 SPY™ 系列染料的明亮且无毒的 F-肌动蛋白染料，适用于活细胞和固定细胞。其优化的结构能够快速标记活细胞和固定细胞中的 F-肌动蛋白，具有高特异性和极低背景。SPY555-actin 可以在无需遗传操作或荧光蛋白过表达的情况下，对活细胞或固定细胞的 F-肌动蛋白进行染色。它的吸收光谱和发射光谱与四甲基罗丹明（TMR）相似。SPY555-actin 可以与 SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR 和 GFP 进行多色成像。它可以使用标准的 TMR 或 Cy3 滤光片组进行成像，并可用于活细胞或固定细胞和组织的宽场、共聚焦、SIM 或 STED 成像。包含一瓶 SPY555-actin（冻干品）。
艾美捷SPY555-肌动蛋白探针（#CY-SC202）特性：
吸收峰（λabs）：555 nm
荧光峰（λfl）：580 nm
是否适用于固定细胞：是，适用于甲醛固定的细胞
探针数量：100 次染色
荧光寿命：2.4 ns
STED 消耗波长：660 nm 或 775 nm
运输条件：室温
储存条件：-20°C
储存与操作
收到后请将探针保存在 -20°C 或以下。冻干探针在室温下可稳定保存超过 1 周，在 -20°C 下可稳定保存超过 12 个月。使用无水 DMSO 复溶 SPY555-actin。我们建议使用新开封的无水 DMSO 来制备 1000×储备液。DMSO 与空气和水分接触会产生降解产物，这会显著缩短探针在溶液中的保质期，即使在 -20°C 下也是如此。使用后，请将 1000×储备液保存在 -20°C 或以下。在打开小瓶之前，应让其恢复至室温。如果储存得当，1000×储备液可稳定保存 3 个月。注意：DMSO 溶液应特别小心处理，因为 DMSO 已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关当地法规处理这些试剂。
图：用共聚焦显微镜与STED显微镜成像的SPY标记的HeLa细胞的比较。使用93X物镜拍摄，由Spirochome提供。
标记协议
注意：本协议是使用贴附在盖玻片上的 HeLa 细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到确认。本协议中的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SPY555-actin 基于选择性 F-肌动蛋白配体雅斯普霉素的衍生物。在高剂量下，它可能会改变活细胞中的肌动蛋白代谢。因此，如果计划进行长期（>12 小时）成像实验，建议使用 1000 倍或更高倍数稀释的 SPY555-actin。对于所有其他用途，建议使用 1000 倍稀释的 SPY555-actin 进行染色。
1. 配制 1000×储备液
向 SPY555-actin 小瓶中加入 50 µL 无水 DMSO，制备 1000×储备液。我们建议使用新开封的无水 DMSO 来制备 1000×储备液。DMSO 与空气和水分接触会产生降解产物，这会显著缩短探针在溶液中的保质期，即使在 -20°C 下也是如此。此时，溶液可能会有颜色，但这不会影响探针的性能。使用后，应将该溶液保存在 -20°C 或以下。不要将 1000×储备液分装成小份量，因为它们会更快降解，且该探针不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液可稳定保存 3 个月。
2. 配制染色液
将 SPY555-actin 稀释到 1×浓度，加入常用的细胞培养基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暂涡旋。如果不能一次完成稀释，请使用 DMSO 制备中间稀释液，因为使用水性缓冲液制备中间稀释液会导致探针聚集。快速进行下一步。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用 1000 倍稀释液进行染色，然后在后续实验中优化 SPY555-actin 的稀释倍数，直至达到最佳染色效果。仅使用新配制的染色液，不要重复使用。
3. 细胞准备与染色
按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用步骤 2 新鲜配制的染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育，并根据下表确定标记时间与探针浓度的关系。
4. 细胞成像
SPY555-actin 的成像最好使用标准的 TMR 或 Cy3 设置。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液，通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针保留在成像介质中，以获得稳定的信号。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果可维持数小时。
基于以下条件：每次染色实验使用 0.5 mL 1×探针浓度的染色液。通过减少体积或探针浓度，可以进一步增加染色实验的次数。
标记时间是针对 HeLa 细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。
https://www.amyjet.com/products/CY-SC202.shtml
PAK磁珠,Rac1/Cdc42结合域蛋白磁珠纯度测定&储存方案
人类 p21 活化激酶 1 蛋白（PAK）的 Rac/Cdc42 结合域已被过表达为带有 GST 标签的重组蛋白，并在细菌表达系统中与颜色编码的谷胱甘肽琼脂糖珠子结合。重组蛋白（氨基酸 67-150）包括高度保守的 PBD 区域（也称为 CRIB 区域）以及与 GTP-Rac 和 GTP-Cdc42 蛋白高亲和力相互作用所需的序列。重组蛋白在其氨基末端带有 GST 标签（28 kDa），其近似分子量为 34 kDa。PAK-GST 蛋白珠子（每管含 500 µg 蛋白）以紫色冻干粉形式提供。一管 PAK02 应足以进行大约 25 次测定。
艾美捷PAK磁珠,Rac1/Cdc42结合域蛋白磁珠（#PAK02-A）生物学活性测定：
PAK-GST 蛋白能够特异性识别并结合 Rac 和 Cdc42 蛋白的活性“GTP 结合”形式（1），而对 Rac 和 Cdc42 的非活性“GDP 结合”形式亲和力较低。当与颜色编码的谷胱甘肽琼脂糖基质结合时，PAK-GST 蛋白珠子成为检测 Rac 和 Cdc42 蛋白活性的便捷工具。PAK-GST 蛋白珠子的标准生物学测定包括从加载了 GTPγS 或 GDP 的人血小板提取物中拉下 Rac 蛋白。
图 1：PAK-GST 蛋白珠子纯度测定
将 20 µg 的 PAK-GST 蛋白珠子样本（分子量约为 34 kDa）通过 12% SDS-PAGE 系统进行电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。蛋白定量采用 Precision Red 蛋白测定试剂（货号：ADV02）进行。Mark12 分子量标记来自 Invitrogen。
图 2：PAK-GST 蛋白珠子在体外对 Rac1 的 GTP 结合形式的特异性结合
将 120 µg 脑提取物加载 GTPγS（泳道 2）或 GDP（泳道 3），如方法所述。然后将提取物与 20 µg 的 PAK-GST 蛋白珠子孵育。通过离心回收蛋白-珠子复合物，并使用针对 Rac1 的特异性单克隆抗体进行 Western blot 分析。泳道 1 显示 50 ng 的重组 His-Rac1 对照蛋白（注意：由于存在 6×His 标签，His-Rac1 的泳动位置略高于内源性 Rac）。SeeBlue 分子量标记来自 Invitrogen。
储存与复溶
短暂离心以使产品聚集在管底。每管蛋白结合珠子应通过加入 500 µL 蒸馏水复溶至 1 mg/ml。复溶后，蛋白-珠子将处于以下缓冲液中：50 mM Tris，pH 7.5，50 mM NaCl，2.0%（质量/体积）葡聚糖和 10%（质量/体积）蔗糖。蛋白-珠子基质将呈现紫色，便于检测。储存时，应将颜色编码的珠子悬浮液分装成实验用量大小，在液氮中快速冷冻并保存在 -70°C。在此条件下，蛋白珠子可稳定保存 6 个月。我们推荐每次实验测定使用 20 µl 的分装量（20 µg 蛋白）（见本协议中的生物学活性测定）。为保持高生物学活性，蛋白-珠子悬浮液不应多次经历冻融循环。如果在 4°C 下干燥保存至<10%湿度，冻干蛋白珠子可稳定保存 1 年。
纯度
通过扫描密度法对 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上考马斯亮蓝染色的蛋白进行分析，确定蛋白纯度。PAK-GST 蛋白珠子的纯度被确定为 88%（见图 1）。
试剂
1. PAK-GST 蛋白珠子（货号：PAK02）
2. 上样缓冲液（150 mM EDTA）
3. 停止缓冲液（600 mM MgCl₂）
4. 洗涤缓冲液（25 mM Tris，pH 7.5，30 mM MgCl₂，40 mM NaCl）
5. 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，10 mM MgCl₂，0.3 M NaCl，2% IGEPAL）
6. GTPγS（20 mM 溶液）
7. GDP（100 mM 溶液）
8. 牛脑或猪脑提取物（20 mg/ml），在 50 mM PIPES，pH 7.0，130 mM NaCl，1 mM PMSF，1 mM DTT，5 µg/ml 胰蛋白酶抑制剂，0.5% Triton X-100 中制备
9. 蛋白酶抑制剂混合液（货号：PIC02）
10. 抗 Rac1 单克隆抗体（货号：ARC03）
设备
1. 4°C 微型离心机
2. SDS-PAGE 和 Western blot 装置
文献参考：
1. Manser, E. et al. 1994. Nature. 367: 40-46.
https://www.amyjet.com/products/PAK02-A.shtml