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摘要

本文详细阐述了穿孔介导重组杆状病毒转染昆虫细胞的研究，包括实验方法、结果及讨论。研究结果表明，电穿孔转染法操作简便、周期短、成本低，且转染效率与脂质体转染法接近，为重组杆状病毒在昆虫细胞中的高效表达提供了重要的实验基础。

引言

特性与价值
重组杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，具有高效表达目的蛋白的能力，并能对蛋白进行修饰和加工，使其具备一定的生物学和免疫学活性。该系统在基因工程产品的生产中得到了广泛应用，尤其在昆虫细胞中，重组杆状病毒可以高效感染并分泌大量可溶性重组蛋白。

遗传转化体系的意义
构建重组杆状病毒遗传转化体系对于提高基因工程产品的产量和质量具有重要意义。与其他病毒表达系统相比，杆状病毒表达系统具有阳性重组率高、重组体不需要空斑纯化即可获得的特点，大大减少了鉴定和纯化时间及成本。

材料与方法

实验材料

1. 昆虫细胞：Sf9细胞，来源于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。

2. 重组杆状病毒：构建带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组杆状病毒基因组（GFP/BAC）。

3. 试剂：Cellfectin脂质体转染试剂，电穿孔缓冲液，Grace昆虫细胞培养基。

4. 仪器：电穿孔仪（威尼德电穿孔仪），荧光显微镜。

实验方法

1. 重组杆状病毒基因组的构建

• 以质粒为模板，用PCR扩增GFP基因。

• 将扩增的GFP基因连接到穿梭质粒pFastBac上，构建重组穿梭质粒。

• 将重组穿梭质粒转化到E.coli DH10Bac中，获得带有GFP基因的重组杆状病毒基因组。

2. 昆虫细胞的准备

• 将Sf9细胞在Grace昆虫细胞培养基中培养至对数生长期。

• 将细胞离心沉淀，用电穿孔缓冲液重悬，调整细胞密度。

3. 电穿孔转染

• 将重组杆状病毒基因组与昆虫细胞在电穿孔缓冲液中混和。

• 将混合液加入电转杯中，置于冰水浴中。

• 使用电穿孔仪进行电穿孔，条件为140 V，25 ms。

• 电穿孔后，将细胞铺于六孔板中，用生长液培养。

4. 脂质体转染

• 将重组杆状病毒基因组与Cellfectin脂质体试剂混和，静置30 min。

• 将混合液加入含有Sf9细胞的六孔板中，培养5 h。

• 更换新鲜生长液，继续培养。

5. 观察与检测

• 在荧光显微镜下观察细胞转染情况，计算阳性转染率。

• 收集细胞上清液，制备子代重组杆状病毒，并检测其感染能力。

实验结果

转染效率的比较
通过电穿孔转染法和脂质体转染法将重组杆状病毒基因组转染到Sf9细胞中，比较两者的转染效率。结果显示，电穿孔转染法的转染效率为86.14%，脂质体转染法的转染效率为86.53%。两者转染效率接近，但电穿孔法操作简便，周期较短，成本较低。

子代重组杆状病毒的感染能力
将两种方法获得的子代重组杆状病毒继续感染Sf9细胞，观察其感染能力。结果显示，两种方法获得的子代重组杆状病毒均能继续感染Sf9细胞，荧光强度无明显差异。

讨论

外植体关键因素

1. 细胞状态：细胞的状态是影响转染率的重要因素。对数生长期的细胞具有较高的分裂活性，易于接受外源基因的导入。在本研究中，选择对数生长期的Sf9细胞进行转染，获得了较高的转染效率。

2. 电穿孔条件

• 电压：电压是影响电穿孔转染效率和细胞存活率的关键因素。电压太低，转染率不高；电压太高，细胞存活率会受到极大影响。在本研究中，通过优化电压条件，获得了较高的转染率和细胞存活率。

• 脉冲时间：脉冲时间也是影响电穿孔转染效率的重要因素。适当的脉冲时间可以确保细胞膜形成足够的纳米孔隙，使外源基因顺利进入细胞。

3. 温度

• 低温条件可以稳定细胞膜，增加细胞膜的收缩，减缓细胞膜上孔隙的封闭速度，从而使更多的外源性基因进入到细胞内。在本研究中，电穿孔操作在冰水浴中进行，获得了较高的转染率。

遗传转化策略
重组杆状病毒表达系统具有高效表达目的蛋白的能力，并能对蛋白进行修饰和加工。在本研究中，通过构建带有GFP基因的重组杆状病毒基因组，成功实现了在昆虫细胞中的高效表达。此外，该方法还可以应用于其他外源基因的表达，为基因工程产品的生产提供了重要的工具。

研究的创新与应用前景

1. 创新：本研究首次将电穿孔转染法应用于重组杆状病毒在昆虫细胞中的转染，并与传统的脂质体转染法进行了比较。结果表明，电穿孔转染法具有操作简便、周期短、成本低等优点，为重组杆状病毒在昆虫细胞中的高效表达提供了新的方法。

2. 应用前景

• 基因工程产品的生产：重组杆状病毒表达系统可以高效表达目的蛋白，并具有对蛋白进行修饰和加工的能力。因此，该方法在基因工程产品的生产中具有广阔的应用前景。

• 生物医学研究：重组杆状病毒表达系统还可以用于生物医学研究，如病毒载体的构建、基因治疗等。通过优化转染条件，可以进一步提高重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达效率，为生物医学研究提供更多的工具。

结论

本研究通过构建带有GFP基因的重组杆状病毒基因组，成功实现了在昆虫细胞中的高效表达。通过比较电穿孔转染法和脂质体转染法的转染效率，发现两者转染效率接近，但电穿孔法操作简便、周期短、成本低。此外，该方法还可以应用于其他外源基因的表达，为基因工程产品的生产提供了重要的工具。本研究为重组杆状病毒在昆虫细胞中的高效表达提供了新的方法，具有重要的科学意义和应用价值。