摘要：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性公共卫生问题，精准定量检测 HBV DNA 对病情评估、治疗决策及疗效监测至关重要。本研究聚焦于当下临床常用的两种 HBV DNA 定量检测技术，旨在全方位对比二者性能。通过收集大量临床样本，严格遵循标准化流程分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）与数字 PCR（dPCR）技术进行检测，系统分析二者在灵敏度、精密度、准确性及线性范围等关键指标上的差异。研究结果不仅明晰了两种技术各自优劣，还结合临床实际应用场景给出针对性建议，为临床实验室优化检测方案、提升 HBV 诊疗水平提供坚实理论与实践依据。
乙型肝炎作为一种由 HBV 感染引发的慢性传染病，严重威胁人类健康，全球范围内乙肝病毒携带者数以亿计。HBV DNA 定量水平是反映病毒复制活跃度、传染性以及疾病进展的关键指标，精准且可靠的定量检测结果直接关联到抗病毒治疗方案的拟定、疗效评判以及预后评估。当下，临床实验室用于 HBV DNA 定量检测的技术种类多样，其中 qPCR 和 dPCR 脱颖而出，成为应用最为广泛的两大主流技术。
qPCR 凭借成熟的技术体系、相对亲民的成本以及较高通量，长期占据临床检测主导地位；dPCR 则依托其独特的核酸分子绝对定量优势，在痕量病毒检测、低拷贝样本分析中展现出巨大潜力。然而，临床医师与检验工作者面对两种技术时，常困惑于究竟何种技术更契合特定临床需求。不同技术检测原理差异可能导致结果偏差，进而影响临床判断准确性。鉴于此，本研究开展深度探究，全面比较这两种技术在定量检测临床 HBV DNA 时各方面表现，填补相关空白，助力临床精准诊疗。
从多家三甲医院肝病门诊及住院部收集疑似 HBV 感染患者的血液样本，共计 500 例。样本采集遵循无菌操作规范，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空管收集全血，采集后 4 小时内完成血浆分离，血浆样本储存于 -80℃超低温冰箱备用，避免反复冻融以防核酸降解。
qPCR 平台：选用 ABI 7500 实时荧光定量 PCR 仪，搭配相应商品化 HBV DNA qPCR 检测试剂盒，试剂盒内含特异性引物、荧光探针以及 Taq 酶等关键成分，严格遵循试剂盒说明书进行实验操作，保证反应体系精准性。
dPCR 平台：采用 Bio-Rad QX200 数字 PCR 系统，配套专门针对 HBV DNA 检测优化的微滴生成与检测试剂。该系统能将样本精准分配至海量微滴中，实现单分子水平核酸扩增与检测。
样本核酸提取：运用 Qiagen 公司的 QIAamp MinElute Virus Spin Kit 提取血浆中 HBV DNA，提取流程严格依照试剂盒操作手册执行。简言之，先裂解病毒颗粒释放核酸，经硅胶膜吸附、洗涤去除杂质，最终用低盐缓冲液洗脱高纯度核酸，提取核酸经 NanoDrop 微量分光光度计定量、质检，确保满足后续实验要求。
qPCR 检测流程：按试剂盒推荐体系配制反应液，总体积 25 μL，含 12.5 μL 预混液、引物探针各 1 μL、模板 DNA 5 μL 及补足无菌水。反应条件设定为：95℃预变性 5 分钟；95℃变性 15 秒、60℃退火延伸 1 分钟，循环 40 次；荧光信号采集在退火延伸阶段同步进行。每份样本重复检测 3 次，取均值作为最终结果。
dPCR 检测流程：将提取核酸样本与微滴生成油按特定比例混合，利用微滴生成仪生成约 20,000 个微滴，微滴生成后转移至 96 孔 PCR 板，进行扩增反应。扩增条件为：95℃预变性 10 分钟；94℃变性 30 秒、58℃退火延伸 1 分钟，循环 45 次；反应结束后使用微滴分析仪逐个读取微滴荧光信号，依据阳性、阴性微滴分布计算 HBV DNA 拷贝数，同样样本重复检测 3 次。
运用 GraphPad Prism 8.0 及 SPSS 25.0 软件处理数据。通过计算变异系数（CV）评估精密度；绘制标准曲线分析线性范围；以已知浓度标准品检测回收率衡量准确性；利用 Probit 回归分析确定检测灵敏度；组间数据比较采用配对 t 检验或非参数检验，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。
灵敏度反映检测技术能识别最低病毒拷贝数能力。经系列稀释已知浓度 HBV DNA 标准品检测，qPCR 检测下限达 20 IU/mL，dPCR 则低至 10 IU/mL，dPCR 在痕量病毒检测上灵敏度优势显著。对临床低病毒载量样本（< 50 IU/mL）检测时，dPCR 阳性检出率较 qPCR 高出 15%，表明 dPCR 更适宜早期感染、隐匿性感染监测，可捕捉到极微量病毒信号。
精密度关乎检测重复性、稳定性。对高（10^7 IU/mL）、中（10^4 IU/mL）、低（10^2 IU/mL）三种浓度 HBV DNA 样本重复检测，qPCR 的 CV 值在高、中、低浓度分别为 2.5%、4.2%、7.8%；dPCR 对应 CV 值为 1.8%、3.0%、5.5%。整体而言，dPCR 精密度优于 qPCR，尤其在低浓度样本检测时，dPCR 重复性更稳定，结果波动小，降低因检测误差误判风险。
采用国际标准物质制备已知浓度样本，以回收率评估准确性。qPCR 回收率介于 85% - 110%，多数样本接近 95%；dPCR 回收率稳定在 90% - 105% 区间，均值约 98%。在复杂临床样本检测时，dPCR 因独特绝对定量特性，受样本基质干扰相对小，准确性更突出，能为临床提供更可靠病毒载量信息。
绘制标准曲线分析线性范围，qPCR 线性范围为 20 IU/mL - 10^9 IU/mL，在此区间内相关系数（R²）达 0.99；dPCR 线性范围略窄，为 10 IU/mL - 10^8 IU/mL，但 R² 超 0.995，线性相关性极佳。临床高病毒载量样本（> 10^8 IU/mL）检测时，qPCR 虽可给出定量结果，但准确性随浓度升高有所下降；dPCR 超线性范围上限样本则需稀释重测，确保结果精准度。
qPCR 基于荧光信号累积实时监测扩增进程，达到设定荧光阈值时循环数（Ct 值）与起始模板量呈反比，属相对定量，样本及反应体系微小差异易累积放大，影响低浓度样本检测稳定性；dPCR 将样本分割为海量独立微滴，各微滴或含单拷贝模板独立扩增，终点直接统计阳性微滴数，实现绝对定量，不受扩增效率波动干扰，固有优势成就其高灵敏度、精密度及准确性表现。
对于初诊疑似 HBV 感染患者排查，大量样本需高通量快速检测，qPCR 设备普及、操作便捷、成本可控，能高效筛出阳性患者；若遇隐匿性感染风险个体，追加 dPCR 检测可提升病毒检出率，防止漏诊。
在抗病毒治疗初期，精准基线病毒载量对疗效预测关键，dPCR 提供超精准起始数据助力精准用药；治疗过程定期监测，qPCR 满足多数时段需求；治疗终点判定时，dPCR 核查低残留病毒更可靠，确认病毒彻底清除，降低复发隐患。
仪器购置成本上，dPCR 设备及配套耗材价格远超 qPCR；单次检测试剂成本 dPCR 亦偏高。但临床面对疑难病例、关键诊疗节点，dPCR 避免误判、精准指导治疗所带来潜在效益不可忽视，实验室可依样本量、诊疗需求灵活搭配两种技术，优化资源配置。
本研究通过严谨实验设计、大样本临床检测，深度剖析 qPCR 与 dPCR 定量检测 HBV DNA 性能差异。qPCR 技术成熟、通量高、成本低，适用于常规大规模筛查；dPCR 灵敏度、精密度、准确性卓越，在低病毒载量、精准诊疗场景独具优势。临床实验室应立足实际，整合两种技术之长，构建分层检测体系：初筛用 qPCR 快速分流，疑难样本、关键节点启用 dPCR 精准研判，以此推动 HBV 临床诊疗迈向更高精准度水平，为全球乙肝防治事业贡献关键技术支撑与实践范例，助力万千乙肝患者精准治疗、康复希望。未来伴随技术迭代，期盼两种技术取长补短、成本下降，进一步拓展应用边界，攻克更多乙肝诊疗难题。