永生化细胞研究丨ABM试剂及可提供的形式
所谓永生化是细胞生物学术语,指动物细胞因脱分化失败,受到病毒感染、外源恶意代码转染、辐射或药剂作用后,细胞分裂次数限制机制和DNA检查自毁机制失灵,导致具有无限分裂生长能力的过程。
永生化细胞则是指细胞获得持续生长增殖能力的特性,永生化的细胞具有无限增殖生长性，可长期传代，并多伴有核型改变,细胞永生化是癌变的必经途径。由于正常组织来源的原代细胞在通常的体外培养条件下虽可生长和分裂,但经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖,发生衰老和死亡，限制了细胞培养技术的进一步应用,因此有学者通过基因转染等技术将外源性永生化基因导人目的细胞内，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等,以增加永生化的发生率,进而建立永生化细胞株(immortalized cellstrains)以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力,实现细胞间无差异的目的。
永生化细胞策略：
方法A：端粒酶逆转录酶蛋白（TERT）表达
TERT蛋白是端粒酶的催化亚基，在大多数体细胞中通常不活跃。在这种方法中，您可以将编码人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感兴趣的原代细胞中。当hTERT被外源性表达时，细胞能够维持足够的端粒长度以避免衰老。这是最近开发用于细胞永生化的方法。
优点：
1、对于受端粒长度影响Z大的细胞（例如人类细胞）的永生化效果很好
2、Z不可能引起类似癌症的表型
3、使用此方法生成的细胞系具有稳定的基因型并保留关键的表型标记
缺点：
1、与方法B相比，某些细胞类型的永生化成功率可能不高
2、hTERT的过度表达甚至可以在某些细胞类型（例如上皮细胞）中诱导细胞死亡
3、仅使用这种方法可能不足以成功实现永生化
方法B：病毒致癌基因
病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通过抑制肿瘤抑制基因（例如p53和Rb）来实现永生化。这种方法比方法A更快地生效，但可能会改变一些细胞的特性。
优点：
1、永生化的Z快速途径
2、对于难以永生化的原代细胞（例如上皮细胞）很有用
缺点：
1、可能会改变细胞的特性（例如失去接触抑制，基因组不稳定性，细胞周期检查点的破坏）
2、仅使用这种方法可能不足以成功实现永生化
在许多情况下，单独使用方法A和B可能不足以成功实现永生化。最近的研究发现，共同表达hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并产生更真实和正常的细胞模型，具有明确定义的遗传背景。
艾美捷总结了一些常见的永生化方法，每种机制都涉及破坏图中显示的复制过程中的关键基因。
试剂 机制 ABM可提供的形式
SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Ras Suppression of Rb Lentivirus
C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus
Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus
HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
EBV Viral oncogene -
hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
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永生化小鼠雪旺细胞表达神经胶质细胞标记物作用机制
永生小鼠雪旺细胞表达神经胶质细胞标记物（S100，GFAP，p75NTR）；参与施旺细胞发育和外周髓鞘形成的转录因子（Krox2、Oct6、PAX3和SOX10）；和神经营养因子（NGF、BDNF、GDNF和CNTF）。
在生长因子如PDGF-BB、aFGF、bFGF或TGF-β1存在的情况下，这些细胞表现出有丝分裂反应。IMS32细胞可用于研究参与外周神经再生的作用机制，并作为评估神经疾病发病机制的体外模型。用于检测细胞标志物的免疫反应性。
艾美捷abm永生化小鼠雪旺细胞基本参数：
货号：T0295
名称：永生化小鼠施万细胞（IMS32）
生物体：小鼠（M. musculus）
组织：大脑
供体历史：ICR 小鼠
生长特性：贴壁，纺锤形
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮的气相，或低于-130°C。
运输条件：干冰运输。
产品格式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
建议使用 PriCoat™ T25 烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）以促进细胞对培养容器的粘附。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂。
冷冻保存：
使用冷冻保存培养基(TM024)，或含有10% DMSO的完全生长培养基进行冷冻保存。
细胞播种密度（每平方厘米细胞数）：50,000 - 60,000
细胞群倍增时间（小时）：45 - 55
永生化方法：自然永生化
表达：
表达胶质细胞标记物（S100, GFAP, p75NTR）、参与施万细胞发育和周围髓鞘形成过程中的转录因子（Krox20, Oct6, PAX3, 和 SOX10），以及神经营养因子（NGF, BDNF, GDNF, 和 CNTF）。
材料引用：
如果使用此材料导致科学出版物的发表，请按照以下方式引用材料：Applied Biological Materials Inc, 目录编号 T0295。
拆包和储存指南：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将冷冻细胞从干冰包装中转移到-130°C以下的温度中，最好在液氮气相储存中，直到准备使用。
为了确保最高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在-130°C以下或液氮气相中。不要在-70°C储存，因为这会导致活性丧失。
解冻程序：
1. 在37°C水浴中快速解冻细胞，同时轻轻摇晃（最多2分钟）。小瓶盖应保持在水面以上，以最小化污染风险。
2. 用70%乙醇喷洒并擦拭小瓶外部以消毒。从这一点开始，所有操作都应严格在生物安全柜内使用无菌条件进行。
3. 将细胞悬浮液转移到含有5ml预热的完全生长培养基的15ml无菌圆锥管中。以125xg离心细胞5-7分钟。
4. 在不干扰细胞沉淀物的情况下吸去上清液。将细胞沉淀物重新悬浮在推荐的预热的完全生长培养基中，并分装到T25培养瓶中。
5. 在推荐的条件下培养细胞。
传代程序：
下面给出的体积是针对T75瓶的；根据培养容器的大小按比例增加或减少体积。当培养容器80%充满时传代细胞。
1. 吸去培养基，并加入2-3ml预热的0.25% Trypsin-EDTA到培养容器中。
2. 在显微镜下观察细胞以确认脱落（通常在2-10分钟内）。难以脱落的细胞可以放在37°C下，几分钟以促进脱落。
3. 通过向培养容器中加入相等体积的完全生长培养基来中和Trypsin-EDTA。
4. 将培养悬浮液转移到无菌离心管中，并以125xg离心5分钟。实际的离心持续时间和速度可能因细胞类型而异。
5. 吸去上清液，并用预热的新鲜完全生长培养基重新悬浮沉淀物。根据需要将适量的细胞悬浮液添加到新的培养容器中。
6. 在推荐的条件下培养细胞。
永生化小鼠雪旺细胞文献参考：
Watabe, K., Fukuda, T., Tanaka, J., Honda, H., Toyohara, K., & Sakai, O. (1995). Spontaneously immortalized adult mouse Schwann cells secrete autocrine and paracrine growth-promoting activities. Journal of neuroscience research, 41(2), 279–290.
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永生小鼠系膜细胞-SV40的产生、特性以及在科学研究中的应用
永生化细胞系在生物医学研究中扮演着重要角色，它们提供了一个相对稳定和可再生的模型系统，用于研究细胞生物学、疾病机制和药物筛选。SV40（Simian Virus 40）是一种能够在多种哺乳动物细胞中引起肿瘤的病毒，其大T蛋白具有抑制细胞衰老和促进细胞永生化的特性。
永生小鼠系膜细胞-SV40：使用实时PCR技术对永生化细胞系中的SV40基因表达进行了定量分析。
艾美捷abm永生小鼠系膜细胞-SV40基本参数：
货号：T0623
名称：SV40永生化小鼠系膜细胞
生物体：小鼠（M. musculus）
组织：肾脏
生长特性：贴壁，多边形
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰冷链运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）是必需的，以确保细胞贴附在培养容器上。PriGrow IV (TM004) + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂
永生小鼠系膜细胞-SV40的产生：
小鼠系膜细胞通过SV40病毒的大T蛋白转化，可以获得持续的增殖能力。这一过程涉及到大T蛋白对p53和Rb蛋白的结合与抑制，从而解除细胞周期的检查点控制。转化后的细胞表现出永生化特征，包括无限复制能力、缩短的人口倍增时间以及增强的应激抵抗能力。
永生化的小鼠系膜细胞-SV40具有以下特性：
无限增殖能力：细胞可以不受限制地进行分裂，不受Hayflick极限的限制。
表型稳定性：即使在长期培养过程中，细胞也能维持其表型和基因型特征。
生物标志物表达：细胞表达SV40大T蛋白以及其他与细胞增殖和肿瘤发生相关的分子标志物。
永生化的小鼠系膜细胞-SV40在以下领域具有重要应用：
细胞生物学研究：作为模型系统，研究细胞信号传导、细胞周期调控和细胞衰老机制。
疾病模型构建：用于模拟肿瘤发生、发展过程，研究癌症的分子机制。
药物筛选与毒性测试：作为筛选抗癌药物和进行药物毒性评估的实验模型。
基因功能研究：通过基因编辑技术，研究特定基因对细胞增殖和肿瘤发生的影响。
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Cas9表达永生化人小胶质细胞在神经科学研究中的应用
小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，对维持大脑稳态和响应神经损伤具有关键作用。随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR/Cas9系统的应用，研究者能够更精确地探究小胶质细胞的基因功能及其在神经系统疾病中的作用。
表达Cas9的永生人小胶质细胞系是一种经过基因工程改造的细胞模型，它们稳定地表达Cas9核酸酶，这是一种用于基因编辑的强大工具。这些细胞由于携带hTERT基因（人端粒酶逆转录酶），因而具有无限增殖的潜力，对于神经科学研究和药物开发具有重要价值。
艾美捷abm Cas9表达永生化人小胶质细胞基本参数：
货号：T3451
名称：表达Cas9的永生化人微胶质细胞系
生物体：人类（H. sapiens）
组织：大脑
生长特性：贴壁，多边形
细胞类型：稳定细胞系
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰冷链运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
推荐使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）以获得Z佳细胞培养效果。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂。
永生化人小胶质细胞系的建立：
利用SV40大T抗原的永生化技术，结合Cas9/CRISPR系统的基因编辑能力，可以建立稳定表达Cas9蛋白的永生化人小胶质细胞系。这些细胞系具有无限的增殖能力，同时保留了小胶质细胞的表型和功能特性。
Cas9表达的永生化人小胶质细胞具有以下特性：
稳定的Cas9表达：允许进行基因敲除或敲入实验。
免疫表型：维持小胶质细胞特有的表面标记和免疫应答功能。
基因编辑效率：高效率的基因编辑能力，便于进行基因功能研究。
Cas9表达的永生化人小胶质细胞在以下领域具有潜在应用：
基因功能研究：通过基因敲除或敲入探究特定基因在小胶质细胞中的功能。
疾病模型构建：模拟阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的小胶质细胞反应。
药物筛选：作为筛选抗炎药物和神经保护药物的体外模型。
细胞治疗研究：评估小胶质细胞在细胞治疗策略中的潜力和安全性。
表达Cas9的永生人小胶质细胞系拆包和储存说明：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，Z好在液氮蒸汽相储存，直到准备使用。
为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮蒸汽相中。不要储存在-70°C，因为这会导致活性丧失。
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PI4K活性ELISA检测设计&检测结果
PI4激酶活性检测是一种竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA），其信号与测量到的PI(4)P的数量成反比。在加入PI(4)P检测试剂之前，使用EDTA停止酶反应。然后将这种混合物转移到PI(4)P检测板进行竞争性结合。使用过氧化物酶标记的二抗和比色法检测来检测PI(4)P检测试剂与板结合的数量。
磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）是在哺乳动物细胞中发现的最多的单磷酸磷脂酰肌醇。它由磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）产生，该激酶磷酸化磷脂酰肌醇的肌醇环的D-4位置。根据它们的分子质量、由去污剂和腺苷的调节，PI 4-激酶被分类为两种类型，II型和III型。II型PI 4-激酶包括PI4KIIa（PI4K2A），它参与了许多生物过程，从细胞生长到内吞和外排。它还是肿瘤生长的新调节器，并在高尔基体内产生富含PtdIns4P的区域。PI4KIIb（PI4K2B）主要是胞质的，它被招募到膜上并刺激PI(4,5)P2的合成。III型PI 4-激酶，PI4KIIIa（PI4K3A），在丙型肝炎病毒复制中发挥作用。这些病毒利用PI4KIIIa产生富含PI(4)P的环境，增加细胞中PI(4)P的水平。PI4KIIIb（PI4KB）在有丝分裂期间调节高尔基体的重组。由于其调节分泌颗粒释放的能力，这种酶对于葡萄糖诱导的胰岛素分泌至关重要。所有这些都使PI 4-激酶成为一系列生物功能、疾病状态和感染的有趣靶标。
PI4激酶活性测定被设计用于检测和定量PI4-激酶反应的最终产物PI（4）P。
艾美捷PI4K活性ELISA（#EEB-K-4000K）：
分类：试剂盒与检测
筛选：活性，激酶
运输温度：根据目的地使用干冰和/或凝胶冰运输——产品可能分两个盒子运输
储存：第一部分在4-8°C下储存；第二部分在-80°C下储存
PI4K活性ELISA检测设计：
Echelon公司的PI 4-激酶活性ELISA（酶联免疫吸附试验）旨在检测并定量PI 4-激酶反应的最终产物，即PI(4)P。PI4-激酶活性ELISA是一种竞争性ELISA，其信号与测量到的PI(4)P的数量成反比。在加入PI(4)P检测试剂之前，使用EDTA停止酶反应。然后将这种混合物转移到PI(4)P检测板进行竞争性结合。使用过氧化物酶标记的二抗和比色法检测来检测PI(4)P检测试剂与板结合的数量。
PI4K活性ELISA检测结果：
PI4-激酶活性可以通过将含有酶反应产物的孔的吸收值与标准曲线中的值进行比较来估计。将获得的吸光度值与PI（4）P的log（以pmol为单位）/标准进行绘图，以使用S型剂量-反应（可变斜率）相关性生成标准曲线。通过从酶反应获得的吸光度值进行插值，确定pmol中的PI（4）P水平。见下图。
左图：用GraphPad软件进行非线性回归分析，生成PI（4）P标准曲线。采用对数（激动剂）与响应——可变斜率（四参数）分析。为了获得最佳结果，使用0 pmol PI（4）P和空白对照。
右图：反应在室温下进行3小时，用0.33mg/mLPI底物（K-4001K）和1.11mATP振荡。
PI4K活性ELISA文献参考：
1. Jiang, X. et. al. 2022. Targeting PI4KA sensitizes refractory leukemia to chemotherapy by modulating the ERK/AMPK/ OXPHOS axis. Theronostics 12: 6972-6988.
2. Sun, A. et. al. 2003. PPhosphatidylinositol 4-kinase IIIβ mediates contraction-induced GLUT4 translocation and shows its anti-diabetic action in cardiomyocytes. Cellular and Molecular Life Sciences
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CellSafe-BioMycoX支原体消除试剂盒--快速且永久性地消除支原体
BioMycoX支原体消除试剂盒是非抗生素产品，可以永久消除细胞培养中的支原体污染。
艾美捷CellSafe BioMycoX支原体消除试剂盒#E-01, E-02, E-03：
Cat. No Unit Size
E-01 1 Application (Light contamination)
E-02 2 Application(Medium contamination)
E-03 3 Application(Heavy contamination)
CellSafe HiSense BioMycoX支原体消除试剂盒特点：
快速且永久性地消除支原体
生物制剂的组合（非抗生素产品）
补充现有抗生素的不足
可用于所有类型的细胞系
Z小化的细胞毒性
有效范围：摩洛哥菌属和相关有机体（支原体、无形体、尿素原体、螺旋体、昆虫体等）
CellSafe 支原体消除结果（实时PCR）：
使用BioMycoX®支原体qPCR检测试剂盒（目录号QDR-25，CellSafe）进行测试
CellSafe HiSense BioMycoX支原体消除试剂盒相关产品：
BioMycoX Mycoplasma qPCR Detection Kit
BioMycoX Mycoplasma PCR Detection Kit
BioMycoX Mycoplasma PCR Detection Premix
BioMycoX Mycoplasma Prevention Spray
CellSafe致力于提供支原体全面解决方案，可以有效检测、消除和预防影响细胞培养的支原体。作为CellSafe在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的CellSafe产品。
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CellSafe-ResidualQSearch Plus CHO DNA定量试剂盒，助力科研
ResidualQSearch Plus CHO DNA定量试剂盒设计用于使用水解探针的实时聚合酶链式反应（实时PCR或qPCR）定量药物生产过程中残留的宿主细胞DNA。中国仓鼠卵巢细胞是一种哺乳动物细胞系，已广泛用于生产生物药物，这些药物来源于蛋白质、抗体和疫苗等生物来源。
艾美捷CellSafe ResidualQSearch Plus CHO DNA定量试剂盒#CHOP-100特点：
满足韩国食品药品安全部（MFDS）、世界卫生组织（WHO）、欧洲药典（EP）和日本药典（JP）的标准。
用于定量细胞培养衍生药物中宿主细胞残留DNA的量化。
使用带有水解探针的实时PCR（qPCR）技术进行量化。
（FAM标记探针：CHO DNA，HEX标记探针：IAC）
产品中包含经数字PCR验证的CHO基因组DNA标准。
检测限（LOD）：0.3 fg/反应
定量限（LOQ）：3 fg/反应
UDG系统：防止交叉污染
即使DNA片段化，也能获得稳定的检测结果
为了准确定量CHO残留DNA，检测结果不应受样本中DNA大小的影响。在生物制药的生产过程中，由于剪切力的作用导致DNA片段化是很常见的。因此，有必要验证即使样本中的DNA片段过小，也能实现足够的回收率。为了确认DNA片段的大小不会影响测试结果，将大分子量的DNA通过不同强度的声波处理，将其断裂成低分子量的片段，并将结果与未断裂的高分子量DNA获得的结果进行比较。
CellSafe-ResidualQSearchm CHO DNA定量试剂盒包括用于测量样品中残留DNA的定量DNA以及复溶液。进行多项质量检查以确保标准物质的准确定量。
CHO-K1细胞系定期进行支原体检测。提取DNA，使用荧光法进行定量，并稀释至所需浓度。使用数字PCR确认准确的DNA浓度，产品在发货前进行质量控制。经dPCR验证的CHO标准DNA确保了测试的可靠性。
CellSafe-ResidualQSearchm CHO DNA定量试剂盒相关产品：
MycoQSearch Mycoplasma qPCR Detection Kit
MycoQSearch Plus Mycoplasma qPCR Detection Kit
BioMycoX CryoBanker Cell Freezing Medium
Quantitative CHO Genomic DNA
CellSafe致力于提供支原体全面解决方案，可以有效检测、消除和预防影响细胞培养的支原体。作为CellSafe在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的CellSafe产品。
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CellSafe-HiSense cDNA合成主混合物--20分钟内快速合成cDNA
HiSenseTM cDNA Synthesis Master Mix是一种在一体式格式，更方便快捷第一链cDNA的合成。
主混合物含有M-MLV（莫罗尼小鼠白血病病毒）逆转录酶（RTase）、核糖核酸酶抑制剂，dNTP和Oligo（dT）s。
寡聚体(dT)是能够与mRNA的3'-Poly(A)尾部退火的寡核苷酸。寡聚体(dT)的用途限于具有3'-Poly(A)尾部的mRNA或总RNA模板。
一般说明：
纯化的poly(A)+ mRNA和总RNA都可用于第一链cDNA合成，但poly(A)+ mRNA可能会产生更高的产量和更纯的最终产品。
RNA样本必须无基因组DNA污染。
要去除与cDNA互补的RNA，加入1 µl (2 U)的大肠杆菌RNase H，并在37°C下孵化20分钟。
第一链cDNA合成完成后，cDNA产品可以直接作为标准PCR/qPCR中的模板使用。
艾美捷CellSafe HiSense cDNA合成主混合物#CDS-100, CDS-200, CDS-400, CDSM-200, CDSM-400, LCDS-96, LCDS-480：
CellSafe-HiSense cDNA合成主混合物特点：
包含MMLV逆转录酶（RTase）、核糖核酸酶抑制剂、dNTPs以及优化比例的寡聚体(dT)和随机引物
能在不到20分钟内快速且准确地合成cDNA
易于使用的主混合类型
cDNA合成反应体积：10µl
协议：
1）解冻RNA模板和一体化5X cDNA主混合物在冰上。轻轻但彻底地混合溶液。
2）在冰上的PCR管中制备以下反应混合物
3）将成分充分混合，并通过短暂离心收集。在以下反应条件下培养混合物。
4）新合成的第一链cDNA已准备好用于直接下游应用程序，或用于长期存储温度为-20°C。
CellSafe-ResidualQSearchm CHO DNA定量试剂盒相关产品：
HiSense DLRTaq PCR Polymerase/ Master Mix/ Premix
HiSense Multiplex PCR Master Mix/ Premix
HiSense QPlex qPCR Master Mix
HiSense QGreenBlue qPCR Master Mix
CellSafe致力于提供支原体全面解决方案，可以有效检测、消除和预防影响细胞培养的支原体。作为CellSafe在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的CellSafe产品。
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