永生化细胞两大策略及常见永生化方法
永生化细胞指体外培养细胞自发或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而获得无限增殖能力的过程。永生化细胞具有无限增殖生长性，可长期传代。
研究永生化细胞的意义：
1.能使传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生，获得更多的细胞资源；
2.了解细胞增殖与衰老的分子机制；
3.体外研究癌变多阶段的良好模型，为肿瘤治疗、抑制肿瘤细胞增殖等提供基础
细胞永生化策略：
有两种主要方法：
方法A：端粒酶逆转录酶蛋白（TERT）表达
TERT蛋白是端粒酶的催化亚基，在大多数体细胞中通常不活跃。在这种方法中，您可以将编码人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感兴趣的原代细胞中。当hTERT被外源性表达时，细胞能够维持足够的端粒长度以避免衰老。这是最近开发用于细胞永生化的方法。
优点：
1、对于受端粒长度影响Z大的细胞（例如人类细胞）的永生化效果很好
2、Z不可能引起类似癌症的表型
3、使用此方法生成的细胞系具有稳定的基因型并保留关键的表型标记
缺点：
1、与方法B相比，某些细胞类型的永生化成功率可能不高
2、hTERT的过度表达甚至可以在某些细胞类型（例如上皮细胞）中诱导细胞死亡
3、仅使用这种方法可能不足以成功实现永生化
方法B：病毒致癌基因
病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通过抑制肿瘤抑制基因（例如p53和Rb）来实现永生化。这种方法比方法A更快地生效，但可能会改变一些细胞的特性。
优点：
1、永生化的Z快速途径
2、对于难以永生化的原代细胞（例如上皮细胞）很有用
缺点：
1、可能会改变细胞的特性（例如失去接触抑制，基因组不稳定性，细胞周期检查点的破坏）
2、仅使用这种方法可能不足以成功实现永生化
在许多情况下，单独使用方法A和B可能不足以成功实现永生化。最近的研究发现，共同表达hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并产生更真实和正常的细胞模型，具有明确定义的遗传背景。
图：展示了正常细胞的典型寿命（绿色箭头）。每次分裂，端粒缩短，直到最终达到所谓的衰老状态，此时细胞停止复制并死亡。通过过度表达或抑制特定基因（例如破坏p53和RB途径），我们可以逆转或抑制端粒缩短，使细胞继续分裂而不达到衰老。
艾美捷总结了一些常见的永生化方法，每种机制都涉及破坏图中显示的复制过程中的关键基因。右列描述了abm的永生化试剂系列中可用的形式。您可以在我们的知识库上阅读有关不同病毒的更多信息。
试剂 机制 ABM可提供的形式
SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Ras Suppression of Rb Lentivirus
C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus
Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus
HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
EBV Viral oncogene -
hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
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永生化小鼠雪旺细胞拆包和储存说明
雪旺细胞沿神经元的突起分布，包裹在神经纤维上，雪旺细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成。研究表明，神经元延伸时对与其接触的底物是非常具有选择性的，而且一旦与雪旺细胞接触，神经纤维的延伸就会严格限制在Bungner带内。
艾美捷abm永生化小鼠雪旺细胞基本参数：
货号：T0295
名称：永生化小鼠施万细胞（IMS32）
生物体：小鼠（M. musculus）
组织：大脑
供体历史：ICR 小鼠
生长特性：贴壁，纺锤形
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮的气相，或低于-130°C。
运输条件：干冰运输。
产品格式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
建议使用 PriCoat™ T25 烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）以促进细胞对培养容器的粘附。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂。
永生化小鼠雪旺细胞拆包和储存说明：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，最好在液氮气相储存，直到准备使用。
为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮气相中。不要在-70°C下储存，因为这会导致活性丧失。
冷冻保存：
使用冷冻保存培养基(TM024)，或含有10% DMSO的完全生长培养基进行冷冻保存。
细胞播种密度（细胞数/平方厘米）：50,000 - 60,000
细胞群倍增时间（小时）：45 - 55
永生化方法：自然永生化
表达
表达的标记包括：胶质细胞标记物（S100, GFAP, p75NTR）、参与施万细胞发育和周围髓鞘形成的转录因子（Krox20, Oct6, PAX3, 和 SOX10），以及神经营养因子（NGF, BDNF, GDNF, 和 CNTF）。
材料引用：
如果使用本材料导致科学出版物的发表，请按照以下方式引用材料：Applied Biological Materials Inc, 目录编号 T0295。
保证：
abm保证细胞系在培养开始后在发货后的三十（30）天内是活的，并且它们将符合适用的abm材料产品信息表、分析证书和/或目录描述中的规格。这样的三十（30）天期限在此被称为“保证期限”。
永生化小鼠雪旺细胞文献参考：
Watabe, K., Fukuda, T., Tanaka, J., Honda, H., Toyohara, K., & Sakai, O. (1995). Spontaneously immortalized adult mouse Schwann cells secrete autocrine and paracrine growth-promoting activities. Journal of neuroscience research, 41(2), 279–290.
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永生化犬真皮成纤维细胞- Myc的细胞生物学应用
细胞系的创建：
永生化犬真皮成纤维细胞-Myc是通过将Myc基因引入犬真皮成纤维细胞中，使其获得无限增殖能力的细胞系。这种细胞系的创建对于研究Myc基因在细胞周期控制、细胞衰老以及肿瘤形成中的作用至关重要。
分子机制研究：
使用永生化犬真皮成纤维细胞-Myc可以帮助科学家们深入理解Myc蛋白如何调节细胞的生长和分裂。这些细胞提供了一个模型系统，用于研究Myc过表达与肿瘤发展之间的联系。
癌症研究模型：
由于Myc基因在多种类型的癌症中经常发生突变或过表达，这些细胞系常被用作癌症研究的模型。它们可以用来测试抗癌药物的效果，或者研究癌症治疗策略，如基因沉默或免疫疗法。
细胞生物学应用：
永生化犬真皮成纤维细胞-Myc在研究细胞信号传导、细胞凋亡以及细胞应激反应等方面也有广泛应用。这些细胞系可以用于筛选可能影响这些过程的小分子化合物。
艾美捷abm永生化犬真皮成纤维细胞- Myc基本参数：
货号：T0267
名称：永生化犬皮肤成纤维细胞 - Myc
生物体：狗（Canine）
组织：皮肤
生长特性：贴壁，双极
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮的气相，或低于-130°C
运输条件：干冰运输
产品格式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途
生物安全等级：II
生长条件：需要使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）以促进细胞对培养容器的粘附。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂
永生化犬真皮成纤维细胞- Myc解冻协议：
1. 将细胞在37°C水浴中快速解冻，同时轻轻摇晃（最多2分钟）。瓶盖应保持在水面之上，以最小化污染风险。
2. 用70%乙醇喷洒并擦拭瓶身外部以消毒。从这一点开始，所有操作都应严格在生物安全柜内使用无菌条件进行。
3. 将细胞悬液转移到含有5ml预热的完全生长培养基的15ml无菌圆锥管中。以125xg离心细胞5-7分钟。
4. 在不扰动细胞沉淀物的情况下吸取上清液。将细胞沉淀物重新悬浮在推荐的预热的完全生长培养基中，并分装到T25培养瓶中。
5. 在推荐的条件下培养细胞。
永生化犬真皮成纤维细胞- Myc传代协议：
下面给出的体积是针对T75培养瓶的；根据培养容器的大小按比例增加或减少体积。当培养容器80%融合时传代细胞。
1. 吸取培养基，并加入2-3ml预热的0.25% Trypsin-EDTA到培养容器中。
2. 在显微镜下观察细胞以确认其脱落（通常在2-10分钟内）。难以脱落的细胞可以放入37°C中，几分钟以促进脱落。
3. 通过向培养容器中加入相等体积的完全生长培养基来中和Trypsin-EDTA。
4. 将培养悬液转移到无菌离心管中，并以125xg离心5分钟。实际的离心持续时间和速度可能因细胞类型而异。
5. 吸取上清液，并将沉淀物重新悬浮在预热的新鲜完全生长培养基中。根据需要将适量的细胞悬液添加到新的培养容器中。
6. 在推荐的条件下培养细胞。
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永生人晶状体上皮细胞-SV40的永生化方法
永生化晶状体上皮细胞-SV40是使用Adl2-SV40腺病毒从原代细胞（从婴儿晶状体上皮片段中分离）中建立的。永生人晶状体上皮细胞-SV40为研究正常人晶状体上皮的生理学以及研究其对致白内障药物的反应和人晶状体的特异性功能提供了一个同质的细胞群体。这些细胞还提供了一个独特的系统来检查基因表达和分化之间的关系。细胞与针对SV40大T抗原的单克隆抗体呈阳性反应。
艾美捷abm永生人晶状体上皮细胞-SV40基本参数：
货号：T0573
名称：SV40永生化人晶状体上皮细胞
生物体：人类（H. sapiens）
组织：眼睛
供体历史：婴儿
生长特性：贴壁，多边形
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）是必需的，以确保细胞贴附在培养容器上。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.℃，5% CO2
永生化晶状体上皮细胞-SV40拆包和储存说明：
1、目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2、立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，Z好在液氮蒸汽相储存，直到准备使用。 为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮蒸汽相中。不要储存在-70°C，因为这会导致活性丧失。
冷冻保存：
使用冷冻保存培养基(TM024)，或含有10% DMSO的完全生长培养基进行冷冻保存。
播种密度（细胞数/平方厘米）：5,000 - 10,000
传代比例：1:2
细胞群倍增时间（小时）：76
永生化方法：连续传代和使用携带SV40大T抗原的重组腺病毒转导
表达：
βH-和γ-晶体蛋白
材料引用：
如果使用此材料导致科学出版物的发表，请按照以下方式引用材料：Applied Biological Materials Inc, 货号 T0573。
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永生小鼠系膜细胞-SV40，PCR技术解决方案
永生小鼠系膜细胞-SV40是通过SV40（Simian Virus 40，猴肾病毒40）转导技术使小鼠肾脏系膜细胞获得永生化特性的细胞系。这些细胞保持了原始细胞的多边形贴壁生长特性，广泛应用于肾脏疾病和相关药物的实验研究。
永生小鼠系膜细胞-SV40：使用实时PCR技术对永生化细胞系中的SV40基因表达进行了定量分析。
艾美捷abm永生小鼠系膜细胞-SV40基本参数：
货号：T0623Print
名称：SV40永生化小鼠系膜细胞
生物体：小鼠（M. musculus）
组织：肾脏
生长特性：贴壁，多边形
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰冷链运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）是必需的，以确保细胞贴附在培养容器上。PriGrow IV (TM004) + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂
永生小鼠系膜细胞-SV40拆包和储存说明：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，Z好在液氮蒸汽相储存，直到准备使用。
为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮蒸汽相中。不要储存在-70°C，因为这会导致活性丧失。
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表达Cas9的永生人小胶质细胞系的生长特性和冷冻保存
表达Cas9的永生人小胶质细胞系是一种经过基因工程改造的细胞模型，它们稳定地表达Cas9核酸酶，这是一种用于基因编辑的强大工具。这些细胞由于携带hTERT基因（人端粒酶逆转录酶），因而具有无限增殖的潜力，对于神经科学研究和药物开发具有重要价值。
表达Cas9的永生人小胶质细胞系：这条hTERT永生化人微胶质细胞系稳定表达spCas9核酸酶。
艾美捷abm表达Cas9的永生人小胶质细胞系基本参数：
货号：T3451
名称：表达Cas9的永生化人微胶质细胞系
生物体：人类（H. sapiens）
组织：大脑
生长特性：贴壁，多边形
细胞类型：稳定细胞系
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰冷链运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
推荐使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）以获得最佳细胞培养效果。PriGrow III (TM003) + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂。
冷冻保存：
使用冷冻保存培养基(TM024)，或含有10% DMSO的完全生长培养基进行冷冻保存。
细胞群倍增时间（小时）：24
永生化方法：
通过连续传代和使用表达hTERT的重组慢病毒进行转导。
表达：
人类：NGF（神经生长因子）、Iba1（离子化钙结合适配分子1）、CD45（白细胞共同抗原）、CD68（分化抗原68）
spCas9（特异性核酸酶Cas9）
材料引用：
如果使用此材料导致科学出版物的发表，请按照以下方式引用材料：Applied Biological Materials Inc, 货号 T3451。
表达Cas9的永生人小胶质细胞系拆包和储存说明：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，Z好在液氮蒸汽相储存，直到准备使用。
为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮蒸汽相中。不要储存在-70°C，因为这会导致活性丧失。
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永生小鼠支持细胞（D-4-A）生长条件说明
永生小鼠支持细胞（D-4-A）来源于表达多瘤病毒大T抗原的转基因小鼠。这些细胞是永生的，不能形成肿瘤。细胞表现出的形态是大细胞，在外观上具有广泛的细胞质延伸，但在更高密度下的变化表现出立方体外观。永生小鼠支持细胞（D-4-A）是研究支持细胞生物学的可靠工具。RT-PCR用于检测支持细胞标志物。
艾美捷abm永生小鼠支持细胞（D-4-A）基本参数：
货号：T0649
名称：永生化小鼠索氏细胞（D-4-A）
生物体：小鼠（M. musculus）
组织：睾丸
供体历史：MT-PVLT-10转基因小鼠
生长特性：贴壁，大型，具有广泛的胞质延伸 | 在较高密度下呈现立方形外观
细胞类型：永生化细胞
储存条件：液氮蒸汽相，或低于-130°C
运输条件：干冰冷链运输
产品形式：冷冻
预期用途：本产品仅用于实验室研究。不适用于任何动物或人类的治疗用途，任何人类或动物的消费，或任何诊断用途。
生物安全等级：II
生长条件：
使用PriCoat™ T25烧瓶（G299）或应用细胞外基质（G422）是必需的，以确保细胞贴附在培养容器上。PriGrow III (TM003) + 5% FBS + 1%青霉素/链霉素溶液（G255），37.0°C，5% CO₂
永生小鼠支持细胞（D-4-A）冷冻保存：
使用冷冻保存培养基(TM024)，或含有10% DMSO的完全生长培养基进行冷冻保存。
永生化方法：
源自表达多瘤病毒大T抗原的转基因小鼠。
表达：
转铁蛋白
材料引用：
如果使用此材料导致科学出版物的发表，请按照以下方式引用材料：Applied Biological Materials Inc, 货号 T0649。
永生小鼠支持细胞（D-4-A）拆包和储存说明：
1. 目视检查包装容器是否有泄漏或破损的迹象。
2. 立即将干冰包装中的冷冻细胞转移到低于-130°C的温度中，Z好在液氮蒸汽相储存，直到准备使用。
为了确保Z高的活性水平，在收到后尽快解冻小瓶并开始培养。如果需要继续储存，小瓶应仅储存在低于-130°C或液氮蒸汽相中。不要储存在-70°C，因为这会导致活性丧失。
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PI(4)P抗体的应用，及免疫荧光数据参考
磷脂酰肌醇（PIPn）是细胞膜的次要成分，但却是细胞通讯不可或缺的信号分子。磷脂酰肌醇4-磷酸（PI（4）P）是PI（4，5）P2的生物合成前体，在调节鞘磷脂和糖脂代谢以及高尔基复合体出口的膜运输中具有重要作用。
艾美捷PI(4)P抗体（#EEB-Z-P004）：
纯化的抗磷脂酰肌醇4-磷酸（PtdIns(4)P）单克隆抗体。
亚类：IgM
来源：小鼠
应用：ELISA（酶联免疫吸附试验）、免疫荧光、荧光偏振、蛋白-脂质叠加（PIP条带）
分类：抗体与蛋白质
筛选器：抗体、脂质结合、PI(4)P
运输温度：干冰
存储：2-8°C持续30天，-20°C持续超过30天。不要多次冻融
PI(4)P抗体应用：
ELISA（酶联免疫吸附试验） 0.5 微克/毫升
脂质-蛋白质叠加 1.0 微克/毫升
FP（荧光偏振） 400 微克/毫升
ICC（免疫细胞化学） 8 微克/毫升
其他体外和细胞应用可能使用此抗体，但未经Echelon Biosciences验证。
PI(4)P抗体特性：
形态 液体
储存说明 4°C下储存最多30天。如果需要更长时间储存，分装后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
储存缓冲液 PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.4
浓度 0.5 毫克/毫升
纯度 使用Protein G琼脂糖亲和纯化
免疫原 合成的PI(4)P（磷脂酰肌醇4-磷酸）
克隆性 单克隆；克隆号PI4-2
类型 IgM（免疫球蛋白M）
PI(4)P抗体特异性：
抗PI(4)P主要与所指示的磷脂酰肌醇（无论是合成的还是天然的）的头部反应，并在不同检测格式下对其他磷脂酰肌醇或磷脂表现出低交叉反应性。
数据：免疫荧光
图像已获得Gerald Hammond的许可进行改编。共聚焦图像显示了用抗PI(4)P染色的细胞（左侧）或在染色前预先与PI(4)P预孵化的细胞（右侧）。DAPI对细胞核进行对比染色。
PI(4)P抗体文献参考：
1、Cheong, F. Y., V. Sharma, et al. (2010). Spatial Regulation of Golgi Phosphatidylinositol-4-Phosphate isRequired for Enzyme Localization and Glycosylation Fidelity. Traffic 11(9): 1180-1190.
2、Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinctcellular pools of PtdIns4P and PtdIns(4,5)P(2).Biochem J. 2009;422(1):23-35.
3、Blagoveshchenskaya, A., F. Y. Cheong, et al. (2008).Integration of Golgi trafficking and growth factorsignaling by the lipid phosphatase SAC1. J Cell Biol180(4): 803-12.
4、Weber, S. S., C. Ragaz, et al. (2006). Legionellapneumophila exploits PI(4)P to anchor secretedeffector proteins to the replicative vacuole. PLoSPathog 2(5): e46.
https://www.amyjet.com/products/EEB-Z-P004.shtml