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背景介绍

随着肿瘤的急剧生长，其内部血液供应严重不足，导致氧气的输送受到很大程度的抑制，最终使得肿瘤内微环境明显乏氧。因此，乏氧是晚期实体肿瘤的一个重要环境特征，不仅会促进肿瘤细胞的增殖和转移，同时也是肿瘤治疗过程中的主要障碍之一。因此，调节肿瘤部位乏氧状态被认为是一种改善癌症治疗效果的有效策略（图1）。

图1 肿瘤血管常态化。肿瘤血管(左)和正常血管(右)

肿瘤乏氧标志物

乏氧与肿瘤细胞内生物还原酶的活性密切相关，多种生物还原酶通常会过度表达。此外，乏氧通常也会导致肿瘤其他微环境参数发生变化，如pH值降低、间质流体压力升高、糖酵解和还原能力增强等。

分子探针能对乏氧进行可视化检测，有望实现乏氧肿瘤的准确影像。目前，可激活肿瘤乏氧分子探针的物质包括基于硝基还原酶 (Nitroreductase，NTR)、基于偶氮还原酶 (Azoreductase) 和基于氢醌还原酶 (Quinone Oxidoreductase，hNQO1) 的乏氧分子探针（图2）。

图2 肿瘤乏氧相关标志物[1]

肿瘤乏氧缓解策略

近年来，众多学者尝试以新型纳米生物材料为载体将分子氧输送到肿瘤组织或催化氧气原位生成，以提高肿瘤治疗疗效。根据肿瘤部位氧气补充方式，李从虎等[2]提出3种基于纳米材料缓解肿瘤乏氧的策略：①肿瘤微环境的重塑（内源氧补充）；②纳米氧载体靶向递送（外源氧输送）；③原位氧气催化再生。

例如肿瘤微环境的重塑主要是3种设计思路：利用纳米载体输送抗血管生成药物，使肿瘤血管正常化；利用具有光热效应的纳米材料进行光热治疗；利用纳米载体输送蛋白酶类物质，破坏肿瘤组织处的ECM，使血管舒张，增加肿瘤的血流灌注。如CONG等[3]预先在小鼠瘤内注射透明质酸酶 (hyaluronidase，HAase)，随后尾静脉注射光敏剂二氢卟吩e6 (chlorine e6，Ce6) 偶联的纳米粒 (NM-Ce6)，结果显示HAase可有效分解肿瘤处致密的HA，增加肿瘤血管密度，促进氧气的扩散和粒子的渗透。

细胞缺氧检测试剂盒

Absin公司热卖生化试剂—荧光探针与染料系列，新上两种探针试剂盒：细胞缺氧检测试剂盒-红色荧光和细胞缺氧检测试剂盒-绿色荧光，助力广大科研学者在细胞缺氧方面的研究工作。下面小爱以细胞缺氧检测试剂盒-红色荧光为例，详细介绍该试剂盒的使用方法。

产品简介：

细胞缺氧检测试剂盒是一种利用红色荧光探针进行细胞缺氧状态检测的试剂盒。O92荧光探针可自由透过活细胞膜进入细胞内，并与细胞内的缺氧损伤产物反应，形成红色荧光产物，产生红色荧光。红色荧光随着缺氧程度的增加而增强。因此，根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞缺氧的变化。

O92在激发波长536nm，发射波长580nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内缺氧状况。

适用范围：

本试剂盒可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及新鲜组织振动切片以及冰冻切片的检测。

试剂盒特点：

1、使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

2、背景低，灵敏度高；

3、线性范围宽，使用方便。

使用方法：

仪器：荧光显微镜/流式细胞仪/激光共聚焦/荧光酶标仪、离心机、移液器、冰箱、冰盒；

试剂：PBS缓冲液或者HBSS；

耗材：黑色透明底荧光专用96孔培养板、离心管、吸头、一次性手套；

O92探针标记：

1、O92溶液可在新鲜无血清培养液、PBS、HBSS、HEPES等缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，100-1000倍稀释，以此染色液更换细胞培养液；也可直接向细胞孵育液体中加入O92探针溶液至所需浓度。
2、依据细胞缺氧程度的不同，O92终浓度可选择在100-1000倍稀释的范围，孵育时间可选择60-120min，在37℃进行避光孵育。
3、孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞。
4、检测细胞荧光。

共聚焦/荧光显微镜检测：

对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。

荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，缺氧细胞被染成红色。

流式细胞仪分析：

对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1mL冷PBS重悬细胞（5~10万）。采用480~536nm波长激发，测定580nm~610nm的发射。

阴性细胞仅有较低的荧光强度，缺氧细胞有较强的红色荧光。

[1] 陈华, 覃君霞, 谭必穗等. 肿瘤乏氧分子探针的研究进展[J].广西科学, 2023, 30(4):625-633.
[2] 李从虎, 冯梦梦, 杨妞妞等. 纳米生物材料在肿瘤乏氧缓解策略中的研究进展[J].中国医药工业杂志, 2023.
[3] GONG H, CHAO Y, XIANG J, et al. Hyaluronidase to enhance nanoparticle-based photodynamic tumor therapy [J]. Nano Lett, 2016, 16(4): 2512-2521．

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