背景介绍
过量饮酒会导致肝脏氧化应激、脂肪堆积和炎症。随着酒精性肝病 (ALD) 在全球的流行，ALD的研究迅速增加。目前，许多研究试图发现有效治疗ALD的药物，包括使用抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡和调节肠道微生物群的药物。
甘油三脂检测在ALD研究中的应用
肝脂积聚是酒精性肝病的主要病理特征之一。先前的研究表明，二甲双胍通过抑制硬脂酰辅酶A脱饱和酶1 (SCD1) 或miR-33b的表达来抑制高糖和高胰岛素诱导的肝细胞TG蓄积。还有研究表明，二甲双胍可以通过激活AMPK信号通路逆转脂肪肝。然而，其在ALD中的作用尚不清楚。
Xie等[1]采用一系列检测手段探究了二甲双胍调节酒精性肝病脂代谢的可能机制。其中甘油三酯 (TG) 检测试剂盒(abs580085)用于检测细胞内TG的浓度，以确定二甲双胍对ALD的影响。
甘油三酯检测试剂盒使用方法介绍
检测原理：
甘油三酯 (TG) ，也称为三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和动物脂肪中的主要成分。在人体内，血液中甘油三酯的高水平与动脉粥样硬化、心脏病和胰腺炎有关。试剂盒检测原理是利用脂肪酶对甘油三酯进行水解，产生甘油和游离脂肪酸。随后通过偶联酶促反应在500nm下比色读数，测定释放甘油的量，再换算成甘油三酯的含量。
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 |
96-Well Microplate | 1 plate | — |
Diluent | 20 mL × 1 | 4 ℃ |
Enzyme | Powder × 1 | -20 ℃ |
Dye Reagent | Powder × 1 | -20 ℃ |
Standard (5 mmol/L) | 1 mL × 1 | 4 ℃ |
Plate Adhesive Strips | 3 Strips | — |
Technical Manual | 1 Manual | — |
备注：
1、Enzyme：使用前加入9mL Diluent溶解；
2、Dye Reagent：使用前加入10mL Diluent溶解；
3、Assay Buffer（未提供）：例如制备100mL缓冲液，请将35mL庚烷和65mL异丙醇混合在一起。
操作步骤：
1、试剂和材料
1）自备试剂：Assay Buffer（例如制备100mL缓冲液，请将35mL庚烷和65mL异丙醇混合在一起。）
2）自备材料：酶标仪、蒸馏水、移液器与枪头、离心机、计时器等。
2、样品处理
1）细胞/细菌样品：细胞/细菌（5×106个）离心后弃上清，加入1mL缓冲液，超声处理（功率20%，超声处理3s，间隔10s，重复30次）后，4℃、10000g离心10min，取上清转移至新离心管中，置于冰上待检测；
2）组织样品：称取0.1g组织，加入1mL缓冲液，冰上匀浆后，4℃、10000g离心10min，将上清液转移至新的离心管中，置于冰上待检测；
3）血清/血浆样品：直接置于冰上待检测。
3、标准曲线制备
用蒸馏水对试剂盒提供的标准品（5mmol/L）进行2倍连续稀释，形成标准曲线。
4、样品预实验
对于未知的样品，浓度可能在很大的范围内变化。建议多做几个稀释梯度进行预实验，以确保读数在标准曲线范围内。
5、样品检测
按照以下方式加样完成后，盖上板胶带，混合均匀。将96孔板放入37℃的烘箱中反应10min，随后用酶标仪在500nm下检测吸光值。
试剂 | 样品孔 | 标准品孔 | 空白孔 |
样品 | 10μL | — | — |
标准品 | — | 10μL | — |
蒸馏水 | — | — | 10μL |
Enzyme | 90μL | 90μL | 90μL |
Dye Reagent | 100μL | 100μL | 100μL |
6、样品浓度计算
样品浓度计算试剂盒说明书中提供两种计算方式：标准曲线法、公式法。
针对说明书既有计算公式又有标曲的试剂盒，两种方式任选一种就可以，公式是简便算法。建议按照标曲计算，虽然比较麻烦且耗费试剂，但检测结果会更加准确。按照标曲计算，每一次都需要重新做标曲，因为这种反应是一个变化的过程，检测的数值会随着反应时间、温度等产生变化。
图 甘油三酯检测标准曲线示例（检测限：0.1mmol/L-5mmol/L）
常见问题解答
Q1：我想要检测肝脏细胞在处理后，合成甘油三酯的能力是否改变，我的理解是一方面要检测细胞内的甘油三酯，另一方面也要检测细胞分泌到培养液中的甘油三酯，那么我是不是应该把我处理后的细胞沉淀收取，培养上清也一并保留，这么理解对吗？
A1：理论上是的，既然既要检测细胞内的又要检测分泌出来的，那肯定是要一并保留上清和细胞的。
Q2：如果是将细胞上清收集后检测，那么按照细胞培养上清样品的检测方法，我的培养上清稀释倍数是需要通过预实验来确定吗？
A2：稀释倍数都是要通过预实验来确定的。
Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末状，需要溶解，其中Dye Reagent说明书提示建议现用现配，那我如果想要做预实验的话，这两种试剂溶解后，都能够放在-80℃保存吗？
A3：这样操作是对的，特别是酶，溶解后在-80 ℃保存最好。需要注意的是染料不管是低温还是高温都会氧化，建议老师预实验做完尽早开展实验，一次性多测些样品，防止试剂溶解后长期储存影响检测效果。
Q4：TG试剂盒里面的检测板可以拆分吗？因为如果要做预实验摸索稀释倍数的话，可能只做几个孔。
A4：板子不能拆分，但是可以用常规的96孔酶标板替代做预实验。
Q5：该试剂盒可以检测组织样本，对组织样本的保存有什么要求吗？
A5：没有什么特殊要求，新鲜或者液氮速冻的组织都可以。
[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.
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