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微生物制剂可加重炎症性疾病，如多发性硬化症(MS)，该疾病研究常用的动物模型为实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。百日咳毒素(PTX)是微生物制剂的一种，它是一种细菌毒力因子，通常被用作促进EAE的佐剂。

需要注意的是，EAE模型诱导的成功率受多种因素的影响，包括小鼠的种类和性别、百日咳毒素的剂量、佐剂的使用以及丰富的实验基础和建模经验。此外，在特定应用中，每个批次都要确定最佳剂量。

保存和溶解方法：

保存：我司提供的百日咳毒素为无菌包装的冻干粉，在真空下密封。重溶前后在4°C下可储存6个月，避免冻融；

溶解：百日咳毒素溶于水，可用无菌水或无菌缓冲液重溶。使用前，应轻柔摇晃，使悬液混合均匀。如果需要长期储存，可以在高离子强度缓冲液中进行重溶，如无菌0.1M磷酸钠溶液、pH 7.0；0.5M氯化钠溶液（注意：溶解时轻柔处理，不要进行剧烈漩涡震荡）。

EAE模型文献分享：

在百日咳毒素作为佐剂促进EAE模型的机制探究中，Aline Dumas等人曾报道，PTX会触发IL-6介导的信号级联反应，通过在血管内表面爬行来增加巡逻血管的白细胞数量。随后，Aline Dumas等人又进一步发现PTX通过其ADP核糖基转移酶活性诱导：

1）髓样细胞中的TLR4信号传导，导致促IL-1β合成；
2）一种依赖pyrin的炎性复合物，将促IL-1β裂解为其活性形式。然后，IL-1β刺激附近的基质细胞分泌IL-6。

在没有pyrin的情况下，PTX不会诱导中性粒细胞与大脑毛细血管的黏附，并且在诱导具有脑源性T淋巴细胞小鼠的EAE方面效果较差。该研究确定了激活pyrin的第一个微生物分子PTX，感染后可能影响MS的机制，也是免疫疾病的潜在治疗靶点。

EAE诱导实验方法：

1、主动免疫诱导EAE

1）小鼠两侧皮下注射200μL乳剂。乳剂中含有300μg MOG(35-55)肽（溶解于生理盐水中），并与等量的弗氏完全佐剂混合；

2）免疫后即刻和免疫后第2天分别给予小鼠腹腔注射PTX(20μg/kg)。

2、通过过继转移诱导EAE

1）给小鼠腹腔注射2×107个从免疫诱导EAE后8天处死的小鼠腹部淋巴结和脾脏中分离的淋巴细胞；

2）然后在补充有MOG(35-55)肽(15μg/mL)、小鼠IL-12(5ng/mL)、小鼠IL-23(20ng/mL)，FBS(10%)、1%改良的Eagle培养基（含非必需氨基酸）、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和两性霉素B(250ng/mL)的DMEM培养基中培养2天。

3、EAE症状的评估

小鼠每日体重和评分如下：

0：无疾病迹象；0.5：部分尾部瘫痪；1：完全尾部瘫痪；1.5：一侧后肢无力；2：双后肢无力；2.5：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；3.5：前肢部分瘫痪；4：前肢完全瘫痪；5：因人道原因死亡或死亡。

PTX需要Pyrin来诱导中性粒细胞在血管内爬行，并最大限度地促进EAE。

本期小爱为大家介绍了百日咳毒素作为促进EAE模型的佐剂，在使用过程中的注意事项以及文献常用的造模方法。PTX具有多种生物学活性，能引起百日咳众多的临床症状，同时也是主要的免疫原。与大多数哺乳动物培养细胞结合并特定靶向G蛋白，抑制G蛋白及其在信号通路中的生理功能。正是依赖Gi家族的蛋白偶联受体来抑制信号通路的能力，使得PTX成为细胞生物学研究中的一种重要工具。

Dumas A , Amiable N , Vaccari J P D R ,et al.The Inflammasome Pyrin Contributes to Pertussis Toxin-Induced IL-1β Synthesis, Neutrophil Intravascular Crawling and Autoimmune Encephalomyelitis[J].PLoS Pathogens, 2014, 10(5):e1004150.

免责声明：EAE模型诱导的成功率受多种因素的影响，本文中提供的造模方法来源于已发表的文献，仅供您参考，希望对您成功构建模型有所帮助。

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