磁珠是何方神圣? 如何慧眼识“珠”?生物磁珠一般是具有细小粒径 (μm) 的超顺磁微球。具有以下特点:1) 超强顺磁性,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能均匀分散;
2) 合适且均一的粒径,保证其具有足够强的磁响应性又不会沉降;
3) 丰富的表面活性基团,以便和生物分子偶联,并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
图 1. MCE 磁珠组成
A、G、L、A/G 代表 Protein A、Protein G、Protein L 及 Protein A/G;
Anti-HA、Anti-Flag、Anti-c-Myc、Anti-GST 代表 Anti-HA 抗体、Anti-Flag 抗体、Anti-c-Myc 抗体及 Anti-GST 抗体
选磁珠时,首先关注磁珠磁性 (磁吸时间)、粒径 (大小及均一度) 等。其次根据实验目的,选择合适的表面活性基团以及由此衍生的偶联方式、蛋白结合量等。
比如,如果您的目标蛋白带有融合标签,可一步到位选择:
· Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201)
· Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207)
· Anti-c-Myc Magnetic Beads (HY-K0206)
· Anti-GST Magnetic Beads (HY-K0222)
如果您的目标蛋白带有生物素标记,可选择
· Streptavidin Magnetic Beads (HY-K0208)
如果您有可识别靶蛋白的抗体,可选择
· Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202)
· Protein A Magnetic Beads (HY-K0203)
· Protein G Magnetic Beads (HY-K0204)
· Protein L Magnetic Beads (HY-K0205)
下面以 Protein A/G 磁珠为例,详述 IP 实验步骤、可能存在的问题及解决方法。
■ Step 1——抗原样品制备制备抗原样品 (细胞裂解物) 是 IP 的第一步,也是关键的一步。正确的细胞裂解液可以稳定天然蛋白质构象、抑制酶活性、最大限度地减少抗体结合位点变性并释放细胞或组织中的蛋白质。一般可选 NP-40、RIPA、Western 及 IP 细胞裂解液等。抗原样品应始终保存在冰上,并将蛋白酶抑制剂 添加到裂解液中以防止蛋白水解。
注 1:Co-IP 实验时,常用 NP-40 等非离子型裂解液,以免破坏蛋白-蛋白相互作用。
注 2:确保目的蛋白在抗原样品中有较高水平表达。
■ Step 2——样本结合通过此步骤,您将获得磁珠—抗体—抗原样品复合物。磁珠、抗体、抗原样品的加样顺序对靶蛋白得率有一定影响。
All in one——直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起;
直接结合——抗体和磁珠先结合,再和抗原样品结合;
间接结合——抗体和抗原样品先结合,再和磁珠结合。
可选步骤 1——抗原样品预处理:为减少非特异性结合,可将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合。(预处理有助于去除在 IP 过程中可能与抗体或磁珠非特异性结合的分子,从而改善信噪比。)可选步骤 2——抗体的交联固定:如果不希望抗体与目标蛋白共洗脱,可在直接结合时,使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。后续使用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。
(直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起,速度最快,但获得的靶蛋白纯度和得率会很低;间接结合靶蛋白得率最高,但在洗脱步骤时,抗体会和靶蛋白一起被洗脱;直接结合,蛋白得率也较高,且可通过交联固定抗体,达到单独洗脱靶蛋白的目的。)
一般情况下,如果靶蛋白丰度较高,直接结合与间接结合差别不大,均可选;如果靶蛋白丰度不高,可选间接结合以获得更高的靶蛋白得率。样本结合步骤中的结合/洗涤缓冲液也非常重要。一般情况下,您的结合/洗涤缓冲液可以为同一种缓冲液,如 TBST/PBST。另外可通过加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤次数等来提高洗杂效率。