蛋白质测序/多肽测序是几种不同蛋白组学相关技术的一个通用术语。公司通常会根据客户的不同项目需求,制定相应的策略。下面概括几个我们目前常用的一些方法。
基于Edman降解的蛋白质N端测序策略
通过苯异硫氰酸酯自动裂解进行化学测序的方法最开始是由Pehr Edman开发了。百泰派克生物科技采用岛津公司的edman测序系统,可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统,可以测定N端的60-70个氨基酸。他们还搭建了LC-MS/MS技术平台进行N端测序,该平台可以测出封闭和修饰的蛋白质末端,与Edman降解法形成互补,使N端测序过程得以顺利进行。
当我们需要鉴定蛋白质的身份时,一般采用HPLC或者LCMS进行蛋白质鉴定。Edman测序流程如下:
蛋白质鉴定技术策略
用合适的蛋白酶切割后(机构一般只会使用胰蛋白酶进行酶切,这样鉴定到的肽段覆盖率大概只在60%。百泰派克生物科技常常用到这6种蛋白酶进行酶切:胰蛋白酶、糜蛋白酶、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N)分别对靶蛋白进行酶切和鉴定,在得到碎裂肽段片段的同时,经过肽段之间的拼接完成蛋白序列100%的测定。),生成多个肽段,分离这些生成的肽段,使用LCMS进行检测。 肽离子会自动破碎,然后将产生的光谱提交给NCBInr或Swissprot等大型数据库进行搜索。 通常情况下,许多常规研究中的生物、物种或它们的同源物都有基因组信息,因此这种方法可以应用于大多数样品。
蛋白从头测序策略
当无法获得生物体的基因组或其他数据库时,可以使用从头测序法进行处理。通过该方法中产出的序列标签,可以推断出DNA引物。denovo蛋白测序流程如下:
1.用蛋白酶对蛋白质样品进行多重酶切
2.用高效液相色谱仪(如Obitrap Fusion Lumos)对纯化后的酶切片段进行一系列质谱分析,得到无偏差准确序列
3.对得到的无偏差准确序列进行质谱鉴定
4.使用MassAnalyzer进行序列反向验证