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产品介绍

β-兴奋剂多合一酶联免疫检测试剂盒

β-Agonist Combo ELISA KIT

简介

β-兴奋剂多合一酶联免疫检测试剂盒

β-Agonist Combo ELISA KIT

简介

克伦特罗（Clenbuterol）、沙丁胺醇（Salbutamol）与莱克多巴胺 (Ractopamine)分别属于众多哮喘药中之最重要的几种，畜牧养殖企业使用这类化学物提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，以提高售价，但这类药物有许多副作用，轻则引起心慌、肌肉震颤、头痛、恶心、呕吐以及脸部潮红等不良反应。尤其对心率失常、高血压、青光眼、糖尿病、甲状腺机能亢进等疾病的患者，其危险性更为严重。若长期食用，甚至有可能引发心脏病或诱发恶性肿瘤。

近年来，起因于β-兴奋剂残留过量导致中毒之案例层出不穷，因此，此类药物残留之检测已是猪肉普遍流通之区域必须面对的重要课题。

   本公司新研发的新型β-兴奋剂多合一（New β-Agonist combo）免疫微量检测试剂可针对目前市面上普遍受重视的三种瘦肉精﹙包括：克伦特罗克、沙丁胺醇、莱克多巴胺﹚作一次性的筛检，使用既简便、费时又短，整个操作过程不到60分钟即可完成，因此已成为广泛用来检测β-兴奋剂残留的检验试剂套组。

反应原理

β-兴奋剂三一酶联免疫检测试剂，主要是利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理，换句话说，就是利用酶结合体与检体中之克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺对微孔中的抗体来进行竞争反应。

在整个反应当中，如果样品中之克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺残留的越多，相对地就会竞争掉越多的相应酶抗体，使得能结合上抗体的对应的完全抗原相对地就会很少，因此，反应中液呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应；反之，若检品中没有含克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺等瘦肉精，则呈色会较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。

试剂内容

1、酶标板（Microtiter well plate）：每条8孔，一板12条。

2、克伦特罗标准品溶液（Clenbuterol standard）：

0 ppb、0.25 ppb、0.5 ppb、1 ppb、2 ppb、4 ppb 各一瓶，1mL /瓶。

3、10倍浓缩洗涤液（10X Concentrate Washing Solution）：一瓶，50 mL /瓶。

4、150倍浓缩酶结合物（100X Concentrate Enzyme Conjugate）：一瓶，0.15 mL /瓶。

5、10倍浓缩酶稀释液（10X Conc. Enzyme Conjugate Dilution Solution）：一瓶，18 mL /瓶。

6、底物（Substrate Solution，TMB）：一瓶，12 mL /瓶。

7、反应终止液（Stop Solution）：一瓶，13 mL /瓶。

试剂套组使用说明

A、注意事项

1.   将待测检品、酶标板、标准品溶液6瓶、10倍浓缩洗涤液、150倍浓缩酶结合物、10倍浓缩酶稀释液、底物、反应终止液，于室温环境下，至少回温40分钟。

2.    工作洗涤液配制。

利用蒸馏水将10倍浓缩洗涤液以1:9之比例稀释（即 1 mL 10倍浓缩洗涤液 + 9 mL蒸馏水），即可作为清洗微孔使用的工作洗涤液。（10倍浓缩洗涤液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）

3.    酶标工作液配制。

使用工作酶结合物专用稀释液将150倍浓缩酶结合物以1:149之比例稀释（即0.1 mL 150倍浓缩酶结合物+ 14.9 mL工作酶结合物稀释液），即完成工作酶结合物配制。稀释后的酶结合物请尽快使用，若保存于-20 ℃，保存期可达一个月；若保存于2~8 ℃，请勿超过一星期。

4.    酶稀释液配制。

利用蒸馏水将10倍浓缩酶稀释液以1:9之比例稀释（即1 mL 10倍浓缩酶稀释液 + 9 mL蒸馏水），即可作为稀释酶结合物的酶稀释液。（10倍浓缩酶稀释液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）

5.    用剩余的测试条孔则放回铝箔袋中，储存于2~8 ℃冰箱。

B、未提供设备及试剂：

酶标仪（Microtiter platespectrophotometer）

离心机（Centrifuge Machine）

可调式50 μL-, 100 μL-, 1000 μL-加液枪（Variablemicropipettes）

C、检品制备

本试剂可检测尿液中残留的β-兴奋剂：

    待测物为尿样请依以下方法进行。

       将尿样装入离心机离管中，以离心机离心（3000-4000rpm），10分钟，后取上       清液30uL进行测试分析。
       检品敏感度: 0.25 ppb
       稀释倍数: 1

D、操作步骤

1、于适当测试孔分别加入30 μL 标准溶液（0, 0.1,  0.5，1.2与2.4ppb）。

2、在另外的测试孔加入30 μL已完成前处理之尿液。

3、再于每一测试孔另再加入120 μL已稀释的酶结合物。

4、轻敲板子四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。

5、将测试孔中之反应液甩掉，再将洗液加满每一测试孔后甩掉，重复洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

7、于每一测试孔加入底物100 μL后，轻敲板子四周，使其充分混合。

8、于室温下避光静置20分钟。

9、加入反应终止液，每一测试孔加入100 μL。

10、酶标仪（Microtiterplate spectrophotometer）设波长450nm 判读。

E、判定

利用Excel将标准品浓度取Ln，与相对应吸光值之B/B0（相对于0值标准品吸光值之百分比）做线性回归分析（semi-log），再将待测检体之B/B0值代入，则可推算出待测检体浓度（如图1所示）。

Absorbance standard（or sample）           B

× 100 =    %

Absorbance（0 ppb standard）            B0

Example：若标准曲线为图1.

待测物吸光值除以标准品0 ppb值之吸光值 = X %

        则待测物浓度= e^{[(59.122-X)/10.748]} ppb

F、检测下限(Detection limit)

β-兴奋剂多合一试剂套组的克伦特罗（Clenbuterol）标准品最低检测下限皆为 0.25 ppb，此浓度之吸光值与阴性标准溶液（0 ppb）之吸光值有明显的差异。最高检测上限为4 ppb，超出此浓度之检体需经适量稀释后再进行检测。

       Fig.1：Calibration Curve for New β-Agonist combo Kits(尿样）

H、再现性(Reproducibility)

针对β-兴奋剂多合一检验试剂之精密度测试，在取样数= 6 之下，所得不同浓度标准溶液之吸光值变异系数（CV%）如下图所示，显示β-兴奋剂多合一检验套组有很高的再现性：

Fig.2：Interassay Precision Profile for New β-Agonist combo Kits

I、交叉反应率(Cross-reactivity)

针对以下β-兴奋剂进行特异性交叉反应测试，结果如下：

经由上述表格换算，1.00 ppb Clenbuterol相当于1.25 ppb Salbutamol，1.18 ppb Ractopamine，1.05 ppb Bromobuterol，1.54 ppb Tulobuterol，5 ppb Terbutaline，0.87ppb Cimaterol，2ppb Mapenterol，1.66 ppb Mabuterol。

J、 检品敏感度(Sensitivity)

各类检体之检测敏感度如下:

K、回收率(Recovery rate)

L、问答（注意事项）

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

           i.    未加入酶结合物。

答: 请确实按照操作步骤进行。

      ii.   试剂盒内容物未能充分回温。

答: 确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

        iii.    室温太低。

答: 若是温太低（< 19℃），请于操作步骤4，适度延长孵育时间（> 40分钟）。

        iv.    未使用试剂盒之洗涤液清洗。

答: 请用试剂盒内所提供之洗涤液清洗。

          v.    试剂盒已过有效期限。

答: 请更换仍在有效期限内之试剂盒。

vi. 终止实验后太久未判读。

答: 请于加入反应终止液后20分钟内判读。

2.  标准曲线线性不佳，与品管报告的曲线不一致，或是平行性不佳。

           i.    孵育位置避光不确实或受到气流干扰。

答: 请确认孵育位置既不透光也不透风（如抽屉内）。

          ii.    操作时间拖太久。

答: 请在方法熟练后再进行操作。

        iii.    微孔间相互污染。

答: 加样品时，请小心勿溅出微孔外，造成其它微孔的污染。

        iv.    标准品或酶结合物所加入的量不一致。

答: 请使用已校正过的加液枪，并确保其与枪头尖之间有高度密合性。

          v.    添加样品或试剂的操作方法不正确。

答: 加样品或试剂时，枪头尖请勿接触微孔。

        vi.    洗板过程发生问题（如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤）。

答: 请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3.  吸光值均偏高（或线性不够陡）。

           i.    室温太高（> 25 ℃）。

答: 若无法降低室内温度，请适度缩短步骤4之反应时间（< 30分钟）。

          ii.    底物（TMB）受到污染。

答: 若发现底物已呈现淡蓝色，请勿再使用。

        iii.    反应时间超过太久。

答: 请确实控制反应时间。

        iv.    酶结合物污染了盒内其它试剂。

答: 使用过之枪头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂

（特别是酶结合物与底物）接触过之容器应立即清洗干净（先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留）。

4.  阴性标准品之吸光值低于阳性标准品之吸光值。

           i.    微孔中之试剂未能充分混合。

克伦特罗（Clenbuterol）、沙丁胺醇（Salbutamol）与莱克多巴胺 (Ractopamine)分别属于众多哮喘药中之最重要的几种，畜牧养殖企业使用这类化学物提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，以提高售价，但这类药物有许多副作用，轻则引起心慌、肌肉震颤、头痛、恶心、呕吐以及脸部潮红等不良反应。尤其对心率失常、高血压、青光眼、糖尿病、甲状腺机能亢进等疾病的患者，其危险性更为严重。若长期食用，甚至有可能引发心脏病或诱发恶性肿瘤。

近年来，起因于β-兴奋剂残留过量导致中毒之案例层出不穷，因此，此类药物残留之检测已是猪肉普遍流通之区域必须面对的重要课题。

   本公司新研发的新型β-兴奋剂多合一（New β-Agonist combo）免疫微量检测试剂可针对目前市面上普遍受重视的三种瘦肉精﹙包括：克伦特罗克、沙丁胺醇、莱克多巴胺﹚作一次性的筛检，使用既简便、费时又短，整个操作过程不到60分钟即可完成，因此已成为广泛用来检测β-兴奋剂残留的检验试剂套组。

反应原理

β-兴奋剂三一酶联免疫检测试剂，主要是利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理，换句话说，就是利用酶结合体与检体中之克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺对微孔中的抗体来进行竞争反应。

在整个反应当中，如果样品中之克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺残留的越多，相对地就会竞争掉越多的相应酶抗体，使得能结合上抗体的对应的完全抗原相对地就会很少，因此，反应中液呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应；反之，若检品中没有含克伦特罗或沙丁胺醇或莱克多巴胺等瘦肉精，则呈色会较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。

试剂内容

1、酶标板（Microtiter well plate）：每条8孔，一板12条。

2、克伦特罗标准品溶液（Clenbuterol standard）：

0 ppb、0.25 ppb、0.5 ppb、1 ppb、2 ppb、4 ppb 各一瓶，1mL /瓶。

3、10倍浓缩洗涤液（10X Concentrate Washing Solution）：一瓶，50 mL /瓶。

4、150倍浓缩酶结合物（100X Concentrate Enzyme Conjugate）：一瓶，0.15 mL /瓶。

5、10倍浓缩酶稀释液（10X Conc. Enzyme Conjugate Dilution Solution）：一瓶，18 mL /瓶。

6、底物（Substrate Solution，TMB）：一瓶，12 mL /瓶。

7、反应终止液（Stop Solution）：一瓶，13 mL /瓶。

试剂套组使用说明

A、注意事项

1.   将待测检品、酶标板、标准品溶液6瓶、10倍浓缩洗涤液、150倍浓缩酶结合物、10倍浓缩酶稀释液、底物、反应终止液，于室温环境下，至少回温40分钟。

2.    工作洗涤液配制。

利用蒸馏水将10倍浓缩洗涤液以1:9之比例稀释（即 1 mL 10倍浓缩洗涤液 + 9 mL蒸馏水），即可作为清洗微孔使用的工作洗涤液。（10倍浓缩洗涤液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）

3.    酶标工作液配制。

使用工作酶结合物专用稀释液将150倍浓缩酶结合物以1:149之比例稀释（即0.1 mL 150倍浓缩酶结合物+ 14.9 mL工作酶结合物稀释液），即完成工作酶结合物配制。稀释后的酶结合物请尽快使用，若保存于-20 ℃，保存期可达一个月；若保存于2~8 ℃，请勿超过一星期。

4.    酶稀释液配制。

利用蒸馏水将10倍浓缩酶稀释液以1:9之比例稀释（即1 mL 10倍浓缩酶稀释液 + 9 mL蒸馏水），即可作为稀释酶结合物的酶稀释液。（10倍浓缩酶稀释液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）

5.    用剩余的测试条孔则放回铝箔袋中，储存于2~8 ℃冰箱。

B、未提供设备及试剂：

酶标仪（Microtiter platespectrophotometer）

离心机（Centrifuge Machine）

可调式50 μL-, 100 μL-, 1000 μL-加液枪（Variablemicropipettes）

C、检品制备

本试剂可检测尿液中残留的β-兴奋剂：

    待测物为尿样请依以下方法进行。

       将尿样装入离心机离管中，以离心机离心（3000-4000rpm），10分钟，后取上       清液30uL进行测试分析。
       检品敏感度: 0.25 ppb
       稀释倍数: 1

D、操作步骤

1、于适当测试孔分别加入30 μL 标准溶液（0, 0.1,  0.5，1.2与2.4ppb）。

2、在另外的测试孔加入30 μL已完成前处理之尿液。

3、再于每一测试孔另再加入120 μL已稀释的酶结合物。

4、轻敲板子四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。

5、将测试孔中之反应液甩掉，再将洗液加满每一测试孔后甩掉，重复洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

7、于每一测试孔加入底物100 μL后，轻敲板子四周，使其充分混合。

8、于室温下避光静置20分钟。

9、加入反应终止液，每一测试孔加入100 μL。

10、酶标仪（Microtiterplate spectrophotometer）设波长450nm 判读。

E、判定

利用Excel将标准品浓度取Ln，与相对应吸光值之B/B0（相对于0值标准品吸光值之百分比）做线性回归分析（semi-log），再将待测检体之B/B0值代入，则可推算出待测检体浓度（如图1所示）。

Absorbance standard（or sample）           B

× 100 =    %

Absorbance（0 ppb standard）            B0

Example：若标准曲线为图1.

待测物吸光值除以标准品0 ppb值之吸光值 = X %

        则待测物浓度= e^{[(59.122-X)/10.748]} ppb

F、检测下限(Detection limit)

β-兴奋剂多合一试剂套组的克伦特罗（Clenbuterol）标准品最低检测下限皆为 0.25 ppb，此浓度之吸光值与阴性标准溶液（0 ppb）之吸光值有明显的差异。最高检测上限为4 ppb，超出此浓度之检体需经适量稀释后再进行检测。

       Fig.1：Calibration Curve for New β-Agonist combo Kits(尿样）

H、再现性(Reproducibility)

针对β-兴奋剂多合一检验试剂之精密度测试，在取样数= 6 之下，所得不同浓度标准溶液之吸光值变异系数（CV%）如下图所示，显示β-兴奋剂多合一检验套组有很高的再现性：

Fig.2：Interassay Precision Profile for New β-Agonist combo Kits

I、交叉反应率(Cross-reactivity)

针对以下β-兴奋剂进行特异性交叉反应测试，结果如下：

经由上述表格换算，1.00 ppb Clenbuterol相当于1.25 ppb Salbutamol，1.18 ppb Ractopamine，1.05 ppb Bromobuterol，1.54 ppb Tulobuterol，5 ppb Terbutaline，0.87ppb Cimaterol，2ppb Mapenterol，1.66 ppb Mabuterol。

J、 检品敏感度(Sensitivity)

各类检体之检测敏感度如下:

K、回收率(Recovery rate)

L、问答（注意事项）

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

           i.    未加入酶结合物。

答: 请确实按照操作步骤进行。

      ii.   试剂盒内容物未能充分回温。

答: 确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

        iii.    室温太低。

答: 若是温太低（< 19℃），请于操作步骤4，适度延长孵育时间（> 40分钟）。

        iv.    未使用试剂盒之洗涤液清洗。

答: 请用试剂盒内所提供之洗涤液清洗。

          v.    试剂盒已过有效期限。

答: 请更换仍在有效期限内之试剂盒。

vi. 终止实验后太久未判读。

答: 请于加入反应终止液后20分钟内判读。

2.  标准曲线线性不佳，与品管报告的曲线不一致，或是平行性不佳。

           i.    孵育位置避光不确实或受到气流干扰。

答: 请确认孵育位置既不透光也不透风（如抽屉内）。

          ii.    操作时间拖太久。

答: 请在方法熟练后再进行操作。

        iii.    微孔间相互污染。

答: 加样品时，请小心勿溅出微孔外，造成其它微孔的污染。

        iv.    标准品或酶结合物所加入的量不一致。

答: 请使用已校正过的加液枪，并确保其与枪头尖之间有高度密合性。

          v.    添加样品或试剂的操作方法不正确。

答: 加样品或试剂时，枪头尖请勿接触微孔。

        vi.    洗板过程发生问题（如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤）。

答: 请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3.  吸光值均偏高（或线性不够陡）。

           i.    室温太高（> 25 ℃）。

答: 若无法降低室内温度，请适度缩短步骤4之反应时间（< 30分钟）。

          ii.    底物（TMB）受到污染。

答: 若发现底物已呈现淡蓝色，请勿再使用。

        iii.    反应时间超过太久。

答: 请确实控制反应时间。

        iv.    酶结合物污染了盒内其它试剂。

答: 使用过之枪头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂

（特别是酶结合物与底物）接触过之容器应立即清洗干净（先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留）。

4.  阴性标准品之吸光值低于阳性标准品之吸光值。

           i.    微孔中之试剂未能充分混合。