SSR引物开发
通过富集微卫星序列,开发出20-30条具有一定重复特征的微卫星序列,并且对序列进行多态性和特异性验证。2. 引物筛选 选取部分代表性样本,利用普通引物进行PCR扩增,然后利用高分辨率芯片电泳或PAGE验证引物的特异性、扩增效率和基因座多态性等信息(图1)。图1. 用岛津MultiNA芯片电泳仪进行引物筛选的结果
3.样本批量扩增
用带有荧光标记(FAM/HEX/TMR/ROX等)的引物,对批量样本进行PCR扩增。我公司拥有高通量PCR仪平台,可以满足大量样本扩增需求。
4.测序仪检测
带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合,用3730xl等测序仪进行毛细管电泳,并得到原始数据(fsa文件,见图2)。
图2. 应用3730xl测序仪检测得到的原始图谱
5.原始数据分析 编制panel和bin等文件,使用正版GeneMapper v4.0软件分析测序仪得到的fsa文件,并生成PDF图谱和Excel文档(包括size、基因分型等信息),分析后的电泳图谱见图3。
图3. GeneMapper软件分析后的电泳图谱
6.群体遗传学分析 利用生物信息学软件(POPGENE、MEGA、PHYLIP、ARLEQUIN等)对上述数据进行进一步分析,绘制遗传连锁图谱、分析连锁不平衡和分析多态性等。