HieffNGS®MaxUpIIDual-modemRNALibraryPrepKitforMGI®MaxUpII13331ES16
- 属性
- 详情
- 产地： 上海
- 关注度： 次
- 品牌： 翌圣生物
- 型号： 13331ES16
- 厂商性质： 生产型,贸易型,服务型,
- 价格： 4563
- 添加时间： 2019/12/30
产品介绍
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hieff NGS? MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI? MaxUp II 双模式mRNA 建库试剂盒 | 13331ES16 | 16 T | 4563.00 |
13331ES96 | 96 T | 22563.00 |
产品描述
Hieff NGS? MaxUp II Dual-model mRNA Library Prep Kit for MGI?是针对MGI?高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为0.1-4μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于MGI?平台测序的文库。
试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
运输与保存方法
冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！
Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。
注意事项
一、 关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
二、应用范围
本试剂盒适用于起始模板量为0.1-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS? RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。
本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。
本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：
基因表达（gene expression）
单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）
基因融合鉴定（gene fusion identification）
剪切变异体分析（splice variant analysis）
三、关于接头连接（Adapter Ligation）
1. 目前华大智造有2种序号的接头：1-128和501-596。关于其使用要求，请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外，华大智造申明：2种接头由于设计工艺不同，禁止混用，否则测序数据无法拆分！
2. 我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表
Input Total RNA | Adapter stock concentration |
100–499 ng | 2 μM |
500–4000 ng | 5 μM |
四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增（Library Amplification）
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*
Input Total RNA | Number of cycles | |
Non-stranded | Stranded | |
100 ng | 12-14 | 14-16 |
1000 ng | 10-12 | 12-14 |
≥2000 ng | 8-10 | 10-12 |
【注】：*由于不同物种和组织所提取的Total RNA中，mRNA的含量差异较大。实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。
六、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit?、PicoGreen?等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop?等。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠：Hieff NGS? DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效产品。
2. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
3. Adapters：详情请咨询华大智造或本公司。
4. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
5. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
三、操作步骤
3.1 mRNA纯化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）
1. 将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。
2. 准备一个Nuclease free离心管，取0.1-4 μg总RNA，用Nuclease free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。
3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。
4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；4℃，hold，使得RNA变性。
5. 室温孵育5 min，使mRNA与磁珠完全结合。
6. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。
7. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
8. 重复步骤7，共洗涤两次。
9. 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
10. 将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。
11. 将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
12. 室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。
13. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
14. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。
15. 将样品从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃或85℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min或85℃，6 min。使用Agilent 2100分析双链cDNA纯化产物大小。
表3 mRNA片段化程序选择
插入片段大小（bp） | 打断程序 |
150-200 | 94°C，6 min； |
200-300 | 94°C，5 min； |
250-450 | 85°C，8 min； |
400-550 | 85°C，6 min； |
16. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中，立刻进入第一链合成反应。
3.2 第一链cDNA的合成：
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
表4 第一链cDNA合成反应体系
名称 | 体积（μL） |
Fragmented mRNA | 17 |
Strand Specificity Reagent | 6 |
1st Strand Enzyme Mix | 2 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表5 第一链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 105°C | On |
25°C | 10 min |
42°C | 15 min |
70°C | 15 min |
4°C | Hold |
3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A：
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。
表6 第二链cDNA合成反应体系
名称 | 体积（μL） |
1st Strand cDNA | 25 μL |
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)* | 30 μL |
2nd Strand Enzyme Master Mix | 5 μL |
【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。
表7 第二链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 105°C | on |
16°C | 30 min |
72°C | 15 min |
4°C | Hold |
3.4 接头连接（Adapter Ligation）
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的MGI?接头。
1. 参考注意事项三中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。
表8 Adapter Ligation体系
名称 | 体积（μL） |
dA-tailed DNA | 60 |
Ligation Enhancer | 30* |
Fast T4 DNA Ligase | 5 |
DNA Adapter | 5** |
【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**请根据注意事项三中表1的提示，用0.1×TE buffer对接头进行稀释，接头体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9所示反应程序，进行接头连接反应：
表9 Adapter Ligation反应程序
温度 | 时间 |
热盖 | Off |
20°C | 15 min |
4°C | Hold |
【注】：当Input DNA量较低时，可尝试将连接时间延长一倍，这将提高连接效率。
3.5 连接产物纯化和片段大小分选（Post Ligation Clean Up and Size Selection）
目前有两个方案应用于该步骤，当插入片段＜200 bp时，使用方案A；当插入片段≥200 bp时，使用方案B。
方案A：适用于插入片段150-200 bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，6 min）
1. 准备工作：将Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行第二轮纯化。
9. 吸取80 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
11. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
12. 重复步骤5，总计漂洗两次。
13. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
14. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。
方案B：适用于插入片段大于200 bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，5 min或85℃，8 min）
方案B-1：接头连接产物的纯化
1. 准备工作：将Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。
【注】：Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。
方案B-2：双轮分选
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表10，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。
表10 文库分选推荐磁珠比例
DNA文库插入片段大小（峰值，bp） | ~ 200 | ~ 300 | ~ 400 | ~ 500 | |
打断条件 | 94℃，5 min | 85℃，8 min | 85℃，8 min | 85℃，6 min | |
接头连接之后分选或文库扩增之后分选 | 第一轮体积比 | 0.78× | 0.68× | 0.58× | 0.48× |
第二轮体积比 | 0.20× | 0.20× | 0.20× | 0.20× | |
【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure? XP磁珠和Hieff NGS? DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为200 bp时，若在接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL。
3. 室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液于管底。
5. 参考表10向上清中加入第二轮分选磁珠。
6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
9. 重复步骤8。
10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。
11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
3.6文库扩增（Library Amplification）
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表11中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表11所示反应体系。
表11 接头连接产物PCR反应体系
组分名称 | 体积（μL） |
2×Ultima HF Amplification Mix | 25 |
Primer Mix for MGI? | 5 |
Adapter Ligated DNA | 20 |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表12示反应程序，进行PCR扩增。
表12 PCR扩增反应程序
温度 | 时间 | 循环数 |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 参照表2（注意事项五） |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 5 min | 1 |
4°C | Hold | - |
3.7 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS? DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。
3.8 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。
3.9 文库环化
使用Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI?（Cat#13341）或其他等效产品进行文库单链环化反应。
附录一：mRNA片段化
- 公司简介
-
来宝会员
翌圣生物科技（上海）股份有限公司【Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.】是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事分子、蛋白和细胞三大品类生物试剂的研发、生…... 了解更多>>
