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产品介绍

产品信息

产品描述

全血直接PCR试剂盒是一款可以直接对全血样本进行PCR扩增的试剂盒，无需DNA提取或样品处理，大大降低了污染风险，缩短了检测时间。

试剂盒中包含配方优化的2× Blood Master Mix，具有很强抑制物耐受性，人血的模板最大加入量可达45%，鼠血的可达20%，可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA片段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，扩增产物末端加A，适用于Hieff Clone^?快速克隆试剂盒（货号：10907ES60/10908ES60）。

该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903^?和FTA^?商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂（EDTA、柠檬酸盐、肝素等）。适用样本来源包括人血、鼠血、鸡血、鸟血、牛血、狗血等。

产品组分

a）2× Blood Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等，产品已混合溴酚蓝染料（不含SDS），PCR产物可以直接进行电泳。

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存。避免反复冻融。

操作方法

1. PCR反应体系配制

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a）模板使用量：进行基因组上的目的片段检测，建议使用少量的血液量作为模板；检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段，建议扩大PCR体系并使用较大量的血液模板。血液模板最多占PCR体系的45%（人血）、20%（鼠血）。若模板使用含有血液的采集卡，可截取直径1-4 mm的血点，直接加入20-50 μL PCR反应体系进行扩增。

b）引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-0.5 μM之间进行调整。

c）反应体系：推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

2. PCR反应条件设置

【注】：a）预变性：95℃，5 min可以让白细胞裂解，释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。

b）退火温度：退火温度设置为引物Tm值即可。然而，使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增，并提高全血模板的扩增效率。因此，如扩增产物特异性较差，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板最适退火温度。

c）延伸时间：按30 sec/kb设定，如不足30 sec，设置30 sec即可。

d）扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。

3. 扩增产物分析

PCR完成后，建议将反应液于1000× g (大约4000 rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要，因为经过PCR循环，反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测，如琼脂糖电泳检测。注意：由于血液本身的原因，PCR 结束后在 PCR 管的底部会出现透明凝胶状物质，此为正常现象。

4. 对照反应

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

4.1 阳性对照反应体系

【注】：a）模板DNA：选用样本纯化的DNA。

b）引物的选择：建议选择该样本较易扩增的基因的引物，如 β-actin 基因或 GAPDH 等。

4.2 阴性对照

PCR反应体系被污染会导致PCR结果出现假阳性，需要设置阴性对照来排除。将使用的移液器枪头浸泡在2× Blood Master Mix中，添加引物，ddH₂O进行PCR扩增；另取ddH₂O作为模板，用目的基因引物进行PCR扩增，以排除PCR体系是否被污染和实验是否有其他污染源。

注意事项

1. 尽量使用新鲜抗凝血。若冻存血，应避免反复冻融。

2. 解冻后2× Blood Master Mix可能出现浑浊，冰上放置1-2 min，待溶液澄清后，上下颠倒混匀，不影响试剂性能。

3. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题与解决方法

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