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产品介绍

BCA Protein Quantification Kit

BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）

产品信息

产品描述

BCA（Bicinchoninic acid）法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu²⁺还原成Cu⁺，产生一种紫蓝色复合物，在562nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。BCA蛋白浓度测定法实现了蛋白质浓度测定的简便、灵敏、快速和稳定性。试剂盒中提供的蛋白标准品为用户制作标准曲线提供了便利。

该BCA蛋白浓度测定试剂盒可用于比色皿法检测，也可用于微孔板法检测。前者虽需较大量（100μL）的蛋白样品，但由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20（v/v），从而降低干扰物质带来的影响。后者操作简单方便，仅需少量（10-25μL）的蛋白样品。不过，由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:8（v/v），某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低最低检测水平。我司提供三种规格的BCA蛋白浓度检测试剂盒，比色皿法分别可做50次，250次，500次。酶标法分别可做500次，2500次，以及5000次。

产品特点

1）灵敏度高，最小检测蛋白量可达0.2μg，检测浓度下限达到10μg/mL。

2）速度快，比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。比传统的Lowry法检测速度约快4倍。

3）线性范围广，20-2000μg/mL浓度范围内有较好的线性范围。

4）不受大部分样品中的化学物质的影响，详情见附表1。

运输与保存方法

冰袋运输。试剂盒中的A、B液室温或4℃保存；蛋白标准品（BSA）长时间不用，可置于-20℃保存，有效期12个月。

注意事项

1）使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量。

2）低温或长期保存，若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37oC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应丢弃，避免对实验结果造成影响。

3）实验操作规范，提高上样量的精确度。

4）每次测定都需做相应的标准曲线，因为显色反应与温度和时间的变化有关，精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作方法

一、配制标准品和工作液

1. 配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考表1和表2。

表1 BSA标准品体系配制（比色皿检测，线性范围20-2000μg/mL）*

*如用比色皿检测，每管需加100μL标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μL。

表2 BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000μg/mL）*

2. 配制BCA工作液

1）计算所需要的总BCA工作液体积。

总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液

【注】：比色皿检测时每个样品加2.0mL BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μL BCA工作液。

2）配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

【注】：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。

二、检测方法

1. 比色皿检测方法（样品：BCA工作液=1:20）

1）各取100μL标准品和待测样品加入到反应管中。

2）每管加入2.0mL BCA工作液，混匀。37℃孵育30min。

【注】：也可室温孵育2h，或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。

3）冷却到室温。分光光度计检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。在10分钟内对所有样品读数。

【注】：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。

4）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD_562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

2. 微孔板检测方法（样品：BCA工作液=1:8）

1）各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。

【注】：样品与工作液比例为1:8，若样品有限，可使用10μL标准品和待检测样品进行检测（即1:20），这时试剂盒的

检测范围为125-2000μg/mL。

2）每孔加入200μl BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。

3）冷却到室温，在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。

【注】：a）由于酶标板的光径比比色皿短，使得酶标板检测需要更好的样品：BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长，建议延长孵育时间到2h。b）延长孵育时间或者提高样品：BCA工作比会增高每个孔的OD_562nm净值，并且降低检测下限和工作线性范围。

4）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD_562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

附表：BCA蛋白浓度测定的兼容性

HB200224