来宝网 2020/8/5点击974次
疫情爆发以来，相关诊断试剂研发生产企业第一时间推出了RT-PCR法的核酸检测试剂盒，通过采集口咽拭子或鼻咽拭子样本，提取纯化病毒的RNA，定性或定量检测“2019-新冠病毒”。这种方法所使用的样本采集与保存容器为“一次性使用病毒采样管”。新冠病毒核酸检测，一次性病毒采样管可谓是功不可没。下面德晟为拟介绍下病毒采样管的构成与使用吧。
关于病毒采样管的组成与生产制造：
采样拭子：采样拭子直接接触采样部位，其采样头的材质与后续的检测关系密切。采样拭子头应该采用Polyester(PE)合成纤维或Rayon(人造纤维)制成，不能使用海藻酸钙海绵或木棒拭子(包括竹签)，拭子头部的材料也不能为棉花制品，因为棉花的纤维对蛋白质的吸附较强，不易洗脱到后续的保存液中；而含有海藻酸钙和木制成分的木棒或竹签折断后浸泡在保存液中也会吸附蛋白，甚至会对后续的PCR反应有抑制作用。
制造拭子头的材料推荐使用PE纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维等合成纤维，不推荐棉花等天然纤维，也不推荐尼龙类的纤维，因为尼龙类纤维(类似于牙刷刷头)吸水性不佳，导致采样量不足，影响检出率。
2、病毒保存液：市场上广泛使用的病毒保存液主要有两种，一种是以运送培养基为基础改良的病毒维持液，另一种则为核酸提取裂解液改良的保存液。
前者的主要成分是Eagle's基础培养液(MEM)或Hank's平衡盐，添加了病毒生存所需的盐类、氨基酸、维生素、葡萄糖以及蛋白质，这种保存液使用酚红钠盐做为指示剂，溶液pH值在6.6-8.0时溶液呈粉红色。保存液中添加了必须的葡萄糖、L-谷氨酰胺和蛋白质，蛋白质的提供形式有胎牛血清或牛血清白蛋白，可以稳定病毒的蛋白质外壳。
由于保存液营养成分丰富，有利于病毒的成活但是也有利于细菌的生长，如果保存液中污染了细菌，则会大量繁殖，其代谢产物中的二氧化碳会使保存液pH值下降，从粉红色变为黄色。因而大多数厂家都在配方中添加了抑菌剂成分，推荐使用的抑菌剂为青霉素、链霉素、庆大霉素及多粘菌素B等，不推荐使用叠氮钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)等抑制剂，因为这些组分对PCR反应有影响。由于这种保存液提供的样本基本是活病毒，可以最大程度保持样本的原始性，后续不仅可以用于病毒的核酸提取检测，还能用于病毒的培养和分离。但是用于检测时应该注意的是必须灭活以后再进行核酸提取纯化。
另一种以核酸提取裂解液为基础配制的保存液，主要成分为平衡盐类、EDTA螯合剂、胍盐(如异硫氰酸胍、盐酸胍等)、阴离子表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、阳离子表面活性剂(如十四烷基三甲基草酸铵)、苯酚、8-羟基喹啉、二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶K等几种或多种组分，这种保存液是直接裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶(RNase)，如果仅用于RT-PCR较为合适，但裂解液可以灭活病毒，这种样本不能用于病毒的培养分离。
病毒保存液使用的金属离子螯合剂推荐使用EDTA盐类(如乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二钠等)，不推荐使用肝素类(如肝素钠、肝素锂)，以免影响PCR检测。
3、保存管：制造保存管的材质应注意选择，有资料提示聚丙烯(Polypropylene)与核酸的吸附有关，特别是在高张力离子浓度时，聚乙烯塑料(Polyethylene)比聚丙烯(Polypropylene)更容易抓住DNA/RNA。聚乙烯-丙烯聚合物(Polyallomer)塑胶与某些特殊处理的聚丙烯(Polypropylene)塑胶容器更适合做DNA/RNA的储存使用。另外，在使用可折断拭子时，保存管应尽量选择高度大于8厘米的容器，以防止在折断拭子时内容物外溅污染。
关于病毒采样管的使用：
使用病毒采样管取样主要分为口咽取样和鼻咽取样：
1、口咽取样：先用压舌板压住舌头，然后将采样拭子头部伸入咽喉部位擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，轻度用力拭抹咽后壁部位，应避免触及舌部。
2、鼻咽取样：以拭子测量鼻尖到耳垂的距离并用手指做标记，将采样拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻腔，拭子伸入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半，使拭子在鼻内停留15-30秒，轻轻旋转3-5次，抽出拭子。
从使用方法不难看出，不管是口咽拭子还是鼻咽拭子，采样都是一个技术活，难度高、易污染，采集样品的质量直接关系到后续的检测，如果采集的样本病毒载量低，容易造成假阴性，难以确诊。