OCTA | 柔脑膜侧支循环障碍导致2型糖尿病小鼠卒中预后不良

来宝网 2022/8/4点击651次

侧支状态可独立预测卒中结果，但对于脑缺血期间侧支循环如何维持脑灌注我们还了解甚少。已知糖尿病会加重缺血性脑损伤，但糖尿病对侧支动态的影响也还未知。因此，美国和日本研究人员Yosuke Akamatsu等使用Doppler光学相干断层扫描（DOCT）对小鼠卒中前后的柔脑膜侧支状态进行了成像研究，发现在C57BL/6小鼠大脑中动脉（MCA）阻塞后立即检测到柔脑膜侧支循环募集，并持续生长。相反在2型糖尿病db/db小鼠模型中观察到侧支募集障碍，伴随卒中预后结果很差。MCA卒中后7天，db/db小鼠仍表现出长期性的逆向MCA回流显著减少。通过静脉注射葡萄糖对比研究发现，db/+小鼠急性诱导高血糖并不会导致卒中后侧支循环障碍，表明仅高血糖状态并不足以影响侧支循环。此外人白蛋白能显著改善db/db小鼠卒中后的侧支循环和卒中结果。研究成果以“Impaired Leptomeningeal Collateral Flow Contributes to the Poor Outcomefollowing Experimental Stroke in the Type 2 Diabetic Mice”发表于Neurobiology of Disease。

背景

2型糖尿病（T2DM）是诱发缺血性卒中的主要危险因素，并且与卒中后长期功能缺陷的风险增加相关，但尚不完全清楚是什么机制导致这一人群卒中结果更差。30%-40%的急性缺血性卒中患者存在高血糖，且高血糖与不良预后独立相关，即使在那些没有被诊断患有糖尿病的人中也是如此。已知高血糖会增加脑缺血期间的氧化应激，但尚不清楚急性高血糖本身或其他潜在的血管病理是否会导致发病率增加。

临床证据表明，侧支状态可预测缺血性卒中患者溶栓治疗结果和反应，良好的侧支状态可以降低溶栓和血管内治疗后出血转化的比例。此外代谢综合征患者在急性缺血性卒中期间侧支状态也较差。因此亟需明确T2DM病患者卒中期间是否出现脑侧支循环调节受损，以及该受损是否与高血糖症有关。

在临床前和临床卒中研究中发现，人白蛋白是一种有效的神经保护剂，可以改善血液循环。然而，尚不清楚白蛋白是否能增强大脑中动脉（MCA）卒中中柔脑膜侧支的流动，以及对血管介入无反应的糖尿病受试者来说，白蛋白是否有效。

多普勒光学相干断层成像技术（DOCT）是一种评估动态脑血流的新技术，具有良好的空间分辨率和速度定量灵敏度。能够在完整颅骨情况下，以相对较高的速度同时对多个单独血管中通过的血流进行量化，还能通过重复测量提供绝对血液灌注值。本研究首次使用DOCT检测了正常和T2DM糖尿病小鼠MCA卒中后柔脑膜侧支血循环的空间和时间变化。结果表明，T2DM小鼠MCA卒中后侧支血流动力学受损并不归因于急性高血糖症，并且人白蛋白改善卒中后侧支循环状态，增强回流侧支血流深入到近端MCA区域。

图1 DOCT系统定量微血管成像的示意图。

结果

01-缺血性卒中后柔脑膜侧支循环随时间的进展和生长情况

使用DOCT观察到大脑中动脉阻塞（MCAO）后，MCA血液流动方向逆转，被称为逆向血流，与基线状态时的顺行流动方向相反（图2A，B）。MCAO手术后，连接远端MCA和ACA的弯曲侧支吻合变得明显（图2B）。基线时，检测到流速和流量从近端到远端MCA逐渐减小（图2A，E，H，J），而血管直径保持不变（图2I）。MCAO后，流速和流量普遍降低（图2B，F，H，J）。

为提高比较准确性，根据分支顺序对闭塞点下游的MCA分支进行分类，其中Seg 1最靠近ACA，距MCA最远；Seg 3相对于Seg 2距MCA较近，距ACA最远（图2G）。在MCAO期间，Seg 1-3流速分别较基线下降56%、31%和13%。此后，Seg 3的流速在MCAO后24 h和7天显著增加（p＜0.05，p＜0.005）（图2C，D，H）。与基线相比，Seg 1的MCA直径在MCAO后7天或MCAO期间也同时增加（p＜0.05，p＜0.01），在其它时间点没有显著变化（图2I）。与流速相似，流量在MCAO期间也减小，但Seg 3流量在MCAO后7天增加（p＜0.001）（图2J）。

图2 MCAO后血液流速、流量和动脉直径的时空流动动力学。（A-D）同一只小鼠MCAO前、中、后的DOCT图像。白色和黑色实心箭头分别表示MCA和ACA分支。血液流动的方向是彩色编码的，流向扫描探针光束的血液被标记为红色，相反方向的标记为绿色。（E，F）基线和MCAO期间的动脉树，展示了不同点的流向和流速。（G）MCA分支的分类示意，最远端的为Seg1，最近端的为Seg 3。（H）MCAO前后流速变化情况，Seg 3中流速随时间逐渐增加。（I）血管直径变化情况，Seg 1直径在MCAO后第7天相对于基线和MCAO期间有所扩大，表明卒中后侧支血管的生长。（J）流量变化情况。

02-db/db小鼠表现出柔脑膜侧支循环募集障碍，且卒中结果更差

基线状态下的生理评估显示，db/db小鼠的血糖浓度和体重显著高于正常血糖、年龄一致的db/+小鼠（表1），这与胰岛素耐受性的效果一致，也与之前的发现一致，即db/db小鼠在MCAO期间血压略高（db/db：92.5±6.5 mmHg；db/+：81.8 ±3.4 mmHg；p＜0.05）。

两基因型在基线状态下的血液流速、流量和血管直径都没有差异（图3A-D）。然而MCA阻塞期间，db/db小鼠从ACA逆行填充MCA的血流较db/+组减少很多，在所有节段中的流速都显著降低（图3A-D）。但MCAO后短时间内各组间各节段的血管直径无显著差异。流量情况与流速相似，db/db小鼠Seg 3的流量在MCAO期间及MCAO后显著降低（p＜0.05），表明侧支循环募集受损，尤其是在近端MCA分支中。长期研究发现，慢性卒中期间，db/db小鼠中观察到的侧支循环损伤似乎长期存在（图3E-H）。尽管在MCAO后第7天，两组的侧支血流和血管均有增长，但db/db小鼠所有节段中的流速都显著小于db/+组（图3E-H）。

图3 db/db小鼠MCAO后侧支循环募集障碍。（A）db/db和db/+小鼠在基线、MCAO期间、重新灌注期间、灌注24h后的DOCT图像。（B-D）两组小鼠每节段血管中流速、血管直径和流量与时间的线性图。（E）两组小鼠在基线、重新灌注期间、卒中后7天的DOCT图像。箭头表明两种小鼠品系都有明显的侧支重塑。（F-H）重新灌注与MCAO后7天间，各节段流速、血管直径和流量的变化。

与异常的侧支状态相关的显著恶化卒中结果体现在MCAO后7天，对梗死面积（p＜0.01；图4A），以及运动功能（云梯测试：p＜0.01；图4B；转角测试：p＜0.05;图4C）的评估方面。在糖尿病小鼠中，更差的卒中结果对应更大的病变尺寸，而在高血糖患者卒情况中，也对应着更差的NIHSS和改良Rankin量表评估结果。

图4 MCAO对db/+和db/db小鼠的影响。（A）梗塞体积；（B）云梯测试；（C）转角测试。

为排除遗传变异对脑血管系统的潜在影响，对db/+和db/db小鼠进行了DiI动脉标记。在连接ACA和MCA的侧支数目（图5A，B）、ACA和MCA吻合与中线的距离（图5C）或PcomA的开放性（图5D）方面，都没有观察到显著差异。表明是侧支募集功能发生了障碍，而侧支循环结构没有缺陷。此外，为确定卒中后续对侧支间连接的效应，在MCAO后7 天定量了同侧脑半球中通过ACA逆向灌注的MCA的数量。发现与db/db组相比，db/+侧支血管直径增加以容纳更多血流，同侧脑半球的ACA和MCA之间的边界区域周围弯曲侧支吻合出现显著扩张（图5A，箭头）。而db/db小鼠的情况相反， MCAO后1周MAC和ACA间灌注的柔脑膜侧支较少（p＜0.05；图5A，B）。

图5 db/db小鼠与db/+小鼠在MCA和ACA之间的柔脑膜吻合程度、MCA区域的尺寸、Pcom开放性方面相似。（A）两品系的DiI标记动脉造影图。黄色插图放大显示了MCA和ACA血管网之间的连接点。（B）DiI灌注测量基线和MCAO后7天MCA和ACA间的连接侧支数量。（C）根据DiI动脉标记法测定，两组小鼠在基线时ACA与MCA间吻合线与中线间的距离无显著差异。（D）PcomA开放性各组间无显著差异，表明两种小鼠具有相似的初级侧支循环程度。

03-仅急性高血糖不足以导致侧支循环募集障碍

为确定在T2DM卒中小鼠中观察到的侧支募集障碍是否归因于高血糖本身，在诱发卒中前对db/+小鼠进行了60 min葡萄糖溶液输注。通过剂量滴定研究确定葡萄糖的最佳量为1.25 g/kg，以匹配db/db小鼠约380 mg/dl的血糖水平（图6A）。腹腔注射葡萄糖溶液后，葡萄糖代谢与野生型小鼠间无显著差异（RANOVA:F_（₁₃₂_）=0.17，p＞0.68）（图6B）。时间进程研究表明诱导组的血糖在卒中和成像期间维持在与db/db小鼠相当的水平（图6C）。在MCAO后，所有组血糖都有升高的趋势，但与MCAO前血糖水平相比无显著差异（图6C）。诱导高血糖的db/+小鼠MCAO后24h血糖水平恢复至正常范围。db/db小鼠在MCAO后24 h虽然血糖水平也出现了暂时降低，但在2天后逐渐恢复到高血糖状态（图6C）。

图6 在db/+小鼠中通过葡萄糖诱导高血糖。（A）腹腔内注射不同剂量的25%葡萄糖溶液后，血糖呈剂量依赖性升高。（B）以1.25 g/kg葡萄糖给药后的90 min内，比较db/+和野生型同窝小鼠的血糖代谢。（C）MCAO前、中、后，db/db小鼠、诱导高血糖小鼠、db/+小鼠（对照）的血糖水平。与C57BL/6小鼠类似，正常血糖和高血糖db/+小鼠中，MCA血流方向在所有节段中都是反向的（图7A）。在基线或MCAO期间，各组之间的流速、血管直径和流量无显著差异（图7A-D），表明暂时诱导的高血糖不足以影响侧支血流动力学。

图7 db/+小鼠中急性诱发的高血糖不会损害卒中期间柔脑膜侧支循环。（A）在基线和MCAO期间，高血糖和正常血糖对照小鼠的DOCT图像。箭头表示在MCAO期间，两组中都有强劲逆向血流（绿色）到达近端MCA分支。（B）流速；（C）直径；（D）流量的定量数据。表明高血糖和对照之间的血流动力学和功能动脉直径没有显著差异，基线和MCAO期间都是如此。

04-人白蛋白能够增加db/db小鼠的侧支灌注并减小梗塞面积

为确定白蛋白对缺血性卒中后侧支循环的影响，在MCAO后150 min或CCA再灌注后60 min，静脉输注白蛋白或盐水。处理前后分别对应缺血再灌注后30 min和90 min，对侧支血流进行成像（图8A）。白蛋白处理前，db/db组各节段的流速和流量都明显低于db/+组，流速Seg 1/Seg 2/Seg 3：p＜0.05/p＜0.01/p＜0.01；流量Seg 1/Seg 2/Seg 3：p＜0.05/p＜0.05/p＜0.05（图8B，C，E），血管直径无显著差异（图8D）。

研究发现，白蛋白显著改善了糖尿病小鼠的侧支循环募集情况（Seg 1、3：p＜0.05；Seg 2：p＜0.01），尤其是在近端MCA（图8F）。虽然db/db小鼠盐水或白蛋白处理后30 min，所有节段的MCA直径都有略微减小的趋势，但两种处理方法间相对直径变化没有显著差异（图8G）。在Seg 2和Seg 3中，与盐水处理相比，白蛋白处理后相对血流量有显著提高（Seg 2：p＜0.005；Seg 3：p＜0.05）（图8H）。白蛋白对近端MCA分支流速和流量情况的改善相对较明显，表明白蛋白处理后，来自ACA的逆向血流能到达更远的距离。而db/+小鼠白蛋白处理后，流速的相对增加并不太明显，与盐水处理组间也无显著差异，ACA远端节段中的相对流速也没有优先增加，这是由于db/+小鼠中已存在良好的侧支募集，此外db/+小鼠的相对直径变化也不显著。同时db/+小鼠中，两种方法处理后血液通量都略有改善间，因此相对流量变化并没有显著差异（图8H）。这些结果表明，白蛋白能有效改善db/db小鼠MCA卒中后柔脑膜侧支循环，使其逆行血流到达MCA区域的闭塞点附近。

在卒中后第7天，白蛋白处理的db/db小鼠与盐水处理小鼠相比，表现出明显较小的梗塞体积（白蛋白vs盐水：3.4±0.4% vs 5.0±0.4%，p＜0.05）。尽管白蛋白对神经保护方面有显著效果（two-way ANOVA，F_（_1,18_） = 9.2，p＜0.01），但并没有有效减少db/+小鼠的卒中尺寸（1.9±0.4% vs 3.0±0.5%，不显著），表明白蛋白的作用有限（图8I）。

图8 人白蛋白能显著增加db/db小鼠缺血性再灌注后近段MCA分支方向的逆向血流。（A）卒中、成像、处理的时间线。（B）再灌注后30 min和90 min的DOCT图像。（C-E）处理前db/db小鼠与db/+小鼠血液流速、流量和血管直径的对比。（F-H）白蛋白和盐水处理后，db/db和db/+小鼠血液流速、流量和血管直径的对比。（I）卒中后7天各组的梗塞尺寸对比。

结论

本研究使用DOCT首次证明了侧支募集是通过MCA及其之间的吻合连接直接进行的，对以前的研究结果进行了补充，证明了柔脑膜侧支吻合为MCAO后的缺血区提供了快速和持续的灌注。此外，MCAO后7天，侧支血流会继续增加，且血管重构程度相当大。通过对比db/db和db/+小鼠，证明糖尿病小鼠侧支循环障碍是大脑血管的慢性病理改变引起的，而不是由急性高血糖单独导致的。此外，白蛋白能够显著改善逆向血液灌注，减少db/db小鼠的梗死体积，但在侧支状态良好的db/+小鼠中白蛋白并无显著的改善效果。因此，T2DM小鼠在慢性灌注不足期间，侧支化的失败可能会导致血液动力学损伤，从而增加缺血性卒中的风险。

参考文献

Akamatsu, Y. , et al. "Impaired Leptomeningeal Collateral Flow Contributes to the Poor Outcome following Experimental Stroke in the Type 2 Diabetic Mice." Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience 35.9(2015):3851-64.

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