J CEREBR BLOOD F MET：固有柔脑膜侧支化对缺血性卒中后快速血流募集的影响
来宝网 2022/7/15点击416次
柔脑膜侧支状态可独立预测卒中结果。美国和日本研究人员Atsushi
Kanoke等使用光学相干断层扫描血管造影术，通过比较固有软脑膜侧支化程度不同的两种品系小鼠，确定了缺血性卒中后侧支流动和下游血液动力学的时空动态。发现C57BL/6小鼠大脑中动脉（MCA）闭塞后，立即检测到柔脑膜侧支血流的强劲补充，并在7天内持续。而Balb/C小鼠在MCA闭塞期间和之后一天，都几乎没有观察到侧支血流募集，虽然闭塞后7天皮质灌注略有提高，但还是造成了更大的梗塞面积和更差的卒中结果。两品系小鼠在MCA闭塞后30min内，穿透性小动脉（PA）的血流量都减少了90%以上，其中Balb/C小鼠的血流量减少更显著，恢复更少。此外，与Balb/C小鼠MCAO闭塞后，毛细血管通过时间的不均匀性也较C57BL/6小鼠延长更多。表明皮质卒中后，固有柔脑膜侧支的范围会影响下游的血液动力学，并对微血管床产生长期影响。研究成果以“The
impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood
flowrecruitment following ischemic stroke”为题发表于Journalof Cerebral Blood Flow & Metabolism。
背景
威利斯环（CW）和柔脑膜（LMA）血管网分别包含初级和次级侧支通路。其中LMA侧支可能涉及向大脑皮层表面提供双向动脉血液、连接大脑前动脉（ACA）和大脑中动脉（MCA）、大脑中动脉（MCA）和大脑后动脉（PCA），并在较小程度上连接ACA和PCA。当CW下游的大脑动脉突然闭塞时，需要招募以上血管招募来维持血液供应。大量证据表明缺血性卒中后的LMA侧支化可作为卒中结果的有力预测指标。因此在急性缺血性卒中患者治疗管理中，通过神经成像技术评定侧支流动状态已成为一项可靠的决策评估，且已经ESCAPE临床验证。已知年龄、血管风险和遗传因素都能影响侧支的发育及动态应答，但对于影响脑血管侧支化的因素并不完全明了。
通过比较近交品系小鼠，对影响固有LMA侧支程度的遗传因素已经有了很好的研究，并已用于预测MCA卒中后的梗死体积。同源图谱确定该遗传变异为Dce1。Dce1等位基因渗入Balb/ C基因组可使野生型Balb/C小鼠软脑膜侧支恢复83%，并在大脑中动脉闭塞（MCAO）后以等位基因依赖的方式恢复脑血流、减少梗塞体积，证实了固有侧支对缺血区脑血流灌注的重要性。
尽管一直固有侧支循环与急性缺血性卒中后脑损伤的严重程度间存在既定联系，但尚不清楚LMA侧支系统补偿脑血流的时间模式，以及它如何影响缺血性卒中后下游较小血管的血液供应。由于没有适当的方法，许多临床前研究无法评估滋养动脉对缺血区域的贡献，只能依赖于评估整体血液灌注或遗体检查。本研究假设LMA侧支程度减小、先前存在的LMA侧支直径减小会影响卒中后血液从软脑膜血管灌注到微血管床，使用光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）评估皮质的脑血流动力学（图1）。使用固有LMA侧支发育程度不同的两种小鼠品系C57BL/6和Balb/C，确定了缺血性卒中后LMA吻合周围的空间和时间动力学。还描述比较了不同侧支血流对下游穿透小动脉和毛细血管中血流的影响，以及不同侧支血流对卒中结果的影响。
01-固有柔脑膜的侧支化是卒中后快速逆向血流募集的原因
为确定固有侧支如何在空间和时间上影响逆行血流，用宽视野Doppler OCT成像并量化远端MCA和ACA血流。基线时，检测到MCA分支的流速从近端（S3）到远端（S1）梯度减小（图3a-c），而两品系的血管直径保持相对恒定（图3d）。dMCAO后30 min，C57BL/6小鼠中观察到强劲的MCA血流逆转以及连接远端MCA和ACA的弯曲侧支吻合，而Balb/C小鼠中没有（图3b）。dMCAO过程中，最靠近ACA和MCA间连接点的远端MCA小动脉（图3a中S1和S2）的血流速度显著降低，C57BL/6组降到其基线值的56%和31%，Balb/C组降低更显著，达基线值的0.2%和1.7%。此后C57BL/6组在dMCAO后7天，MCA小动脉更近端段（S3）的流速和流量逐渐恢复了2-3倍（图3b、c和e）。而Balb/C组S1和S2段的流速、血管直径和流量在dMCAO后7天才显示出程度明显的恢复，可见功能性血流（图3c-e）。使用DOCT评估的不同品系间MCA远端小动脉中LMA血流募集的应变差异，与激光多普勒血流计（LDF）评估的MCA区域的局部脑血流量（rCBF）差异相关（图3f），表明侧支血流的范围可预测缺血区域的整体血流灌注状态。
02-Balb/C小鼠中，卒中引起的MCA区域PA血流量减少会进一步加剧
使用高分辨率Doppler OCT确定逆行的软脑膜侧支血流如何影响下游穿透小动脉（PA）的血流。在直径5mm的颅窗内进行扫描，覆盖ACA和MCA区域，获得OMAG和DOMAG扫描及正面流速图谱（图4a）。发现在MCAO后30min，C57BL/6和Balb/C小鼠MCA区域的总PA流量都显著减少，分别减至基线水平的约13.7%和0.03%（图4a和b）。尽管C57BL/6小鼠在同一时间点的LMA血流减少较缓和，但得到的数据与之前结论一致，即PA是大脑循环的瓶颈。C57BL/6小鼠MCA区域的PA血流在dMCAO后7天逐渐恢复到基线的49.3%，而Balb/C小鼠在同一时间点仅恢复到6.7%（图4b）。品系间总流量的差异也反映在dMCAO阶段未闭合PA的平均横截面直径上（图4c）。两品系小鼠dMCAO期间都检测到ACA区域总流量减少，随后7天内分别恢复到基线的72%和64%（图4e）。C57BL/6小鼠MCA区域PA的最大流速在dMCAO期间和dMCAO后7天显著高于Balb/C小鼠（图4d），而dMCAO期间两品系ACA区域的趋势相反（图4g）。
03-Balb/C小鼠卒中后毛细血管通过时间的不均匀性较C57BL/6小鼠更显著
评估并比较了两品系dMCAO后毛细管通过时间的平均值和空间分布。在遮蔽直径大于15μm的血管后，通过OCTA测速仪获得毛细管平均频（MF）图谱（图5a）。从图2c红色方框的MCA和ACA区域MF信号中推导出通过时间的空间分布特征，包括平均毛细血管通过时间（CTT）和毛细血管通过时间不均匀性（CTTH）。Balb/C小鼠在dMCAO后30min平均CTT增加，并在MCA区域颈总动脉闭塞（CCAO）血流逆转后1h持续，而ACA区域在dMCAO期间及后1天，平均CTT增加（图5b和d），品系间无显著差异。Balb/C小鼠中，卒中引起的CTTH增加一直持续，且dMCAO期间MCA区域的增加显著多于C57BL/6组（图5c和e），导致卒中后微血管阻力增加、氧提取减少。Balb/C小鼠ACA区域的CTTH在dMCAO后也增加了，但在随后的7天恢复。品系间ACA区域的CTTH无显著差异（图5e）。
为确定缺血性卒中后固有LMA侧支的范围是否有助于逆行血流补偿，分析了DiI标记的动脉造影。基线时，C57BL/6小鼠ACA和MCA间相互连接的LMA吻合明显多于Balb/C小鼠（图6a和b），与以前的报告一致。而Balb/C小鼠PcomA开放性显著好于C57BL/6小鼠（图6c）。在三个不同神经轴水平上，两品系从中线到ACA和MCA区域边界的距离相似（图6d），表明两品系小鼠大脑背半球MCA的相对面积相似，与以前的发现一致。
05-柔脑膜血流的快速募集可使梗死体积和神经损伤更小
C57BL/6小鼠在dMCAO后7天，梗死面积较Balb/C小鼠减少更多、水平阶梯和转角测试评估的运动功能更好，表明快速LMA血流募集预示着更好的卒中结果（图6e-g）。虽然Balb/C小鼠的血流流量和rCBF在dMCAO后7天有所改善，但这种晚期血流募集并不能挽救已经因缺血而损失的脑组织，也不能改善卒中后的功能性结果。
结论
本研比较了两种具有不同侧支程度的近交系小鼠，证明了固有LMA侧支对快速侧支血流动力学影响非常大，预先存在的固有侧支化程度与卒中后快速LMA血流补偿和下游血流动力学改善有关。首次使用DOMAG表明实验室动物中，卒中引发的LMA侧支招募取决于固有侧支循环的范围，还进一步阐明了LMA侧支血管下游的血液动力学变化，确定了MCAO反应中软脑膜血管对快速和延迟血流募集的不同机制。
虽然以上研究证明侧支循环范围或状态与缺血性损伤之间存在很强的相关性，但也存在独立于侧支循环、可调节梗塞体积的基因，表明缺血性损伤的生物反应仍十分复杂。研究还表明单独的血管新生对治疗或预治疗缺血性卒中可能效果不大；开放度较低的小血管的增加不会改善灌注情况，需要适当大小的侧支动脉血管，与治疗性血管重建领域观点一致，即与血管新生相比，动脉新生（小动脉大小的增加）是一种更好的替代方法。
参考文献：The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flow recruitment following ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2020):0271678X2094126.
背景
威利斯环（CW）和柔脑膜（LMA）血管网分别包含初级和次级侧支通路。其中LMA侧支可能涉及向大脑皮层表面提供双向动脉血液、连接大脑前动脉（ACA）和大脑中动脉（MCA）、大脑中动脉（MCA）和大脑后动脉（PCA），并在较小程度上连接ACA和PCA。当CW下游的大脑动脉突然闭塞时，需要招募以上血管招募来维持血液供应。大量证据表明缺血性卒中后的LMA侧支化可作为卒中结果的有力预测指标。因此在急性缺血性卒中患者治疗管理中，通过神经成像技术评定侧支流动状态已成为一项可靠的决策评估，且已经ESCAPE临床验证。已知年龄、血管风险和遗传因素都能影响侧支的发育及动态应答，但对于影响脑血管侧支化的因素并不完全明了。
通过比较近交品系小鼠，对影响固有LMA侧支程度的遗传因素已经有了很好的研究，并已用于预测MCA卒中后的梗死体积。同源图谱确定该遗传变异为Dce1。Dce1等位基因渗入Balb/ C基因组可使野生型Balb/C小鼠软脑膜侧支恢复83%，并在大脑中动脉闭塞（MCAO）后以等位基因依赖的方式恢复脑血流、减少梗塞体积，证实了固有侧支对缺血区脑血流灌注的重要性。
尽管一直固有侧支循环与急性缺血性卒中后脑损伤的严重程度间存在既定联系，但尚不清楚LMA侧支系统补偿脑血流的时间模式，以及它如何影响缺血性卒中后下游较小血管的血液供应。由于没有适当的方法，许多临床前研究无法评估滋养动脉对缺血区域的贡献，只能依赖于评估整体血液灌注或遗体检查。本研究假设LMA侧支程度减小、先前存在的LMA侧支直径减小会影响卒中后血液从软脑膜血管灌注到微血管床，使用光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）评估皮质的脑血流动力学（图1）。使用固有LMA侧支发育程度不同的两种小鼠品系C57BL/6和Balb/C，确定了缺血性卒中后LMA吻合周围的空间和时间动力学。还描述比较了不同侧支血流对下游穿透小动脉和毛细血管中血流的影响，以及不同侧支血流对卒中结果的影响。
图1 OCT系统和OMAG方法示意图。（a）1310 nm SD-OCT系统设置示意图。（b）OMAG扫描方案。一个cluster执行八次重复扫描，OMAG算法提取血流信息。400帧形成一个OMAG体积。（c）3D OMAG体积的正面MIP。（d）使用DOMAG算法获得的速度B帧。（e）双向轴向速度图。彩色条表示从大脑下行（负，绿色）和上行（正，红色）血流的红细胞轴向速度，在±6.1mm/s范围内。（f）大脑皮层中下行的PA血流（顶部）和上行的小静脉血流（底部）。（g）X-Y平面矩形切片（顶部）和带有穿过平面的PA和小静脉血流信号的矩形切片（底部）。
图2 OCT毛细血管测速法示意图。（a）OCTA测速扫描协议示意图。（b）掩模对毛细血管血流信号的作用。大于15μm的血管腔被去除掉了。（c）毛细血管中频（MF）图，由300μm深度的3D频率信号的正面投影生成。（d）MF分布及基线与dMCAO间的差异。（e）毛细血管通过时间（CTT）的分布及基线与dMCAO间的差异。（f）在基线和dMCAO时的Gamma函数。
01-固有柔脑膜的侧支化是卒中后快速逆向血流募集的原因
为确定固有侧支如何在空间和时间上影响逆行血流，用宽视野Doppler OCT成像并量化远端MCA和ACA血流。基线时，检测到MCA分支的流速从近端（S3）到远端（S1）梯度减小（图3a-c），而两品系的血管直径保持相对恒定（图3d）。dMCAO后30 min，C57BL/6小鼠中观察到强劲的MCA血流逆转以及连接远端MCA和ACA的弯曲侧支吻合，而Balb/C小鼠中没有（图3b）。dMCAO过程中，最靠近ACA和MCA间连接点的远端MCA小动脉（图3a中S1和S2）的血流速度显著降低，C57BL/6组降到其基线值的56%和31%，Balb/C组降低更显著，达基线值的0.2%和1.7%。此后C57BL/6组在dMCAO后7天，MCA小动脉更近端段（S3）的流速和流量逐渐恢复了2-3倍（图3b、c和e）。而Balb/C组S1和S2段的流速、血管直径和流量在dMCAO后7天才显示出程度明显的恢复，可见功能性血流（图3c-e）。使用DOCT评估的不同品系间MCA远端小动脉中LMA血流募集的应变差异，与激光多普勒血流计（LDF）评估的MCA区域的局部脑血流量（rCBF）差异相关（图3f），表明侧支血流的范围可预测缺血区域的整体血流灌注状态。
02-Balb/C小鼠中，卒中引起的MCA区域PA血流量减少会进一步加剧
使用高分辨率Doppler OCT确定逆行的软脑膜侧支血流如何影响下游穿透小动脉（PA）的血流。在直径5mm的颅窗内进行扫描，覆盖ACA和MCA区域，获得OMAG和DOMAG扫描及正面流速图谱（图4a）。发现在MCAO后30min，C57BL/6和Balb/C小鼠MCA区域的总PA流量都显著减少，分别减至基线水平的约13.7%和0.03%（图4a和b）。尽管C57BL/6小鼠在同一时间点的LMA血流减少较缓和，但得到的数据与之前结论一致，即PA是大脑循环的瓶颈。C57BL/6小鼠MCA区域的PA血流在dMCAO后7天逐渐恢复到基线的49.3%，而Balb/C小鼠在同一时间点仅恢复到6.7%（图4b）。品系间总流量的差异也反映在dMCAO阶段未闭合PA的平均横截面直径上（图4c）。两品系小鼠dMCAO期间都检测到ACA区域总流量减少，随后7天内分别恢复到基线的72%和64%（图4e）。C57BL/6小鼠MCA区域PA的最大流速在dMCAO期间和dMCAO后7天显著高于Balb/C小鼠（图4d），而dMCAO期间两品系ACA区域的趋势相反（图4g）。
图4 卒中后Balb/C小鼠MCA区域PA血流几乎耗尽，恢复很少。（a）两品系小鼠皮质表面下300 μm厚的组织内，OMAG数据的正面MIP（上图）和3D双向DOMAG数据的正面MIP（下图）。轴向速度范围：±6.1 mm/s。确定了每个品系中MCA（b-d）和ACA（e-g）区域内总流量、平均横截面积和最大轴向流速的动态变化。
03-Balb/C小鼠卒中后毛细血管通过时间的不均匀性较C57BL/6小鼠更显著
评估并比较了两品系dMCAO后毛细管通过时间的平均值和空间分布。在遮蔽直径大于15μm的血管后，通过OCTA测速仪获得毛细管平均频（MF）图谱（图5a）。从图2c红色方框的MCA和ACA区域MF信号中推导出通过时间的空间分布特征，包括平均毛细血管通过时间（CTT）和毛细血管通过时间不均匀性（CTTH）。Balb/C小鼠在dMCAO后30min平均CTT增加，并在MCA区域颈总动脉闭塞（CCAO）血流逆转后1h持续，而ACA区域在dMCAO期间及后1天，平均CTT增加（图5b和d），品系间无显著差异。Balb/C小鼠中，卒中引起的CTTH增加一直持续，且dMCAO期间MCA区域的增加显著多于C57BL/6组（图5c和e），导致卒中后微血管阻力增加、氧提取减少。Balb/C小鼠ACA区域的CTTH在dMCAO后也增加了，但在随后的7天恢复。品系间ACA区域的CTTH无显著差异（图5e）。
图5 Balb/C小鼠卒中后，毛细血管通过时间的空间不均匀性显著大于C57BL/6小鼠。（a）通过皮质内3D频率信号正面投影生成的毛细血管平均频率图。Balb/C小鼠MCA（b）和ACA（d）区域的平均毛细血管通过时间（CTT）在dMCAO后显著增加，并持续至CCAO逆转后。卒中后CTTH增加，MCA区域（c）一直升高，Balb/C小鼠ACA（d）区域直到dMCAO后1天前一直升高。Balb/C小鼠dMCAO期间，CTTH的增加显著多于C57BL/6小鼠。
为确定缺血性卒中后固有LMA侧支的范围是否有助于逆行血流补偿，分析了DiI标记的动脉造影。基线时，C57BL/6小鼠ACA和MCA间相互连接的LMA吻合明显多于Balb/C小鼠（图6a和b），与以前的报告一致。而Balb/C小鼠PcomA开放性显著好于C57BL/6小鼠（图6c）。在三个不同神经轴水平上，两品系从中线到ACA和MCA区域边界的距离相似（图6d），表明两品系小鼠大脑背半球MCA的相对面积相似，与以前的发现一致。
05-柔脑膜血流的快速募集可使梗死体积和神经损伤更小
C57BL/6小鼠在dMCAO后7天，梗死面积较Balb/C小鼠减少更多、水平阶梯和转角测试评估的运动功能更好，表明快速LMA血流募集预示着更好的卒中结果（图6e-g）。虽然Balb/C小鼠的血流流量和rCBF在dMCAO后7天有所改善，但这种晚期血流募集并不能挽救已经因缺血而损失的脑组织，也不能改善卒中后的功能性结果。
图6 MCAO前固有柔脑膜侧支的范围可预测C57BL/6和Balb/C小鼠的卒中结果。（a）两品系小鼠动脉造影背视图。放大插图显示C57BL/6小鼠MCA和ACA血管网之间有许多吻合点，但Balb/C小鼠没有。（b）MCA和ACA在基线时连接侧支的量化。（c）两品系小鼠Pcom开放性的评分和比较。（d）三个不同神经轴水平上测定中线与ACA和MCA吻合线之间的距离。（e）Balb/C小鼠卒中后7天的卒中面积仍显著大于C57BL/6小鼠。与卒中后7天的C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在高架水平梯测试（f）时滑过更频繁，转角测试（g）中同侧转弯明显更多，反映出在感觉运动不对称方面有更明显的功能损伤。
结论
本研比较了两种具有不同侧支程度的近交系小鼠，证明了固有LMA侧支对快速侧支血流动力学影响非常大，预先存在的固有侧支化程度与卒中后快速LMA血流补偿和下游血流动力学改善有关。首次使用DOMAG表明实验室动物中，卒中引发的LMA侧支招募取决于固有侧支循环的范围，还进一步阐明了LMA侧支血管下游的血液动力学变化，确定了MCAO反应中软脑膜血管对快速和延迟血流募集的不同机制。
虽然以上研究证明侧支循环范围或状态与缺血性损伤之间存在很强的相关性，但也存在独立于侧支循环、可调节梗塞体积的基因，表明缺血性损伤的生物反应仍十分复杂。研究还表明单独的血管新生对治疗或预治疗缺血性卒中可能效果不大；开放度较低的小血管的增加不会改善灌注情况，需要适当大小的侧支动脉血管，与治疗性血管重建领域观点一致，即与血管新生相比，动脉新生（小动脉大小的增加）是一种更好的替代方法。
参考文献：The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flow recruitment following ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2020):0271678X2094126.
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