来宝网 2023/5/12点击939次
打开离心机，冷却至4℃。并将所用试剂、缓冲液、实验、解剖工具、组织匀浆工具以及离心机转子等预冷至4℃（或放在冰上预冷）。
1.1麻醉
麻醉大鼠（麻醉药物注射/气体麻醉均可）
1.2分离步骤
a)处死大鼠，从颅骨中解剖大脑（可选择需要的脑区），将解剖后部分转移至4℃分离缓冲液A（缓冲液配方见文末）中，洗去杂质。
b)将组织从缓冲液取出，吸干多余水分，称量，测定湿重。称后，仍转移到转移至4℃分离缓冲液A中短时间保存
c)准备组织匀浆化：将组织取出，用分离缓冲液A润湿，用尖头剪刀（如眼科剪）将组织剪碎，剪至糊状小块。
d)使用4℃分离缓冲液A重悬组织糊状小块，然后转移到预冷玻璃容器或离心管（该步骤可选择将组织移入特定匀浆机套管中，重悬液体积可根据容器情况调整）中。
e)在1000转/分钟的转速下或手动玻璃研磨，研磨8-10次，得到均匀无块状组织液。
f)转移到50ml 离心管中，调整体积，得到约5%成分的匀浆液 (即每20 - 30ml匀浆液含有1g组织)。
g)4°C、1000 g离心10分钟，留下上清液。
h)将上清液转移到新管中， 4°C、6200 g离心10分钟，弃上清液。
i)使用分离缓冲液B重悬线粒体(沉淀)， 4°C、6200 g离心10分钟，弃上清液。
j)将沉淀物（即线粒体）重新悬浮在少量分离缓冲液B中（约1g组织中的线粒体悬浮液体积约1ml）。
k)将提取好的纯化线粒体用于实验。
2.1分离缓冲液A
化合物 | 最终浓度 | 1000 ml缓冲液所需量 |
Succrose | 320mM | 109.54 g |
Tris-Cl | 10mM | 1.211 g |
K+EDTA | 1mM | 0.372 g |
BSA | 2.5g/l | 2.5 g |
用Tris, HCl调节pH值至7.4
2.2 分离缓冲液B
不含BSA的分离缓冲液A。
Sumbalová Z, Kucharská J, Kristek F (2010) Losartan improved respiratory function and coenzyme Q content in brain mitochondria of young spontaneously hypertensive rats. Cell Mol Neurobiol 30:751-8.
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