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 　摘要:用D-半乳糖(D-gal)建立衰老动物模型且海马内微注射βA P ,检测各组大鼠开场行为、Y-迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化的方法,研究β-淀粉样蛋白(βA P)对衰老大鼠开场行为及学习记忆能力的影响. 结果是D-gal + NS组、D-gal +βA P组大鼠在新异环境中自发活动和探究行为减少,学习记忆减退,与NS + NS组比较有显著性差异( P< 0. 05 ,P< 0. 01) . 该文得出的结论是βA P与D-gal联合使用可导致脑老化程度加重,学习记忆能力显著减弱.

关键词:β-淀粉样蛋白; 开场行为; 学习记忆; 衰老　　β-淀粉样蛋白(β- amyloidp rotein ,βA P)是老年性痴呆患者的大脑中特有的一种蛋白,它在老年性痴呆的发病机理中的作用已引起人们的重视. 生化研究表明,β-淀粉样蛋白是老年性痴呆患者脑海马和皮层老年斑(SP)的主要成分,它与AD的病理形成过程关系密切. 已有报道βA P对正常大鼠海马神经元的毒害作用,但有关βA P对衰老大鼠的作用,国内外均未见报道,本实验试图在D-半乳糖所

致衰老动物模型基础上进行海马内注射βA P ,观察其对大鼠开场行为和空间分辨学习以及记忆保持能力的影响.

1　材料与方法

1 . 1　动物和试剂

雄性健康SD大鼠,体重100～120g(江苏省实验动物中心提供) , βA P为Sigma公司产品(βA P1 -40 ,Lot NO. 76 H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 为上海试剂二厂产品.

1 . 2　分组和模型建立

将大鼠随机分成4组: ①生理盐水N S + N S组; ②N S +βA P组; ③D-gal + N S组; ④D-gal +βA P组- 1连续注射6周建立衰老动物模型; ①、②组. ③、④组动物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg- 1d动物腹腔注射等量生理盐水. 于第4周进行双侧海马内注射βA P ,每侧注射1μL(4μg/μL) ;对照组注射等量生理盐水. 海马定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥钠(40 mg. kg- 1)麻醉,立体定位仪(日本NAR ISH I GE SN - 3型)上固定,坐标按照图谱,以前囱定位: A P = - 3 . 5 mm , ML = ±2 . 0mm , H = 2 . 7 mm ,钻开颅骨,用微量进样器垂直进针,每侧注射时间为5min ,留针5min ,缓慢起针,局部消毒后缝合皮肤,肌注抗生素抗感染.

1 . 3　行为学检测

连续腹腔内注射6周后进行.

·1 . 3 . 1　开场行为(open field):将动物置于圆形开场检测箱底中央的格内,记录其在3 min跑动(loco motio n)穿过的格数,后肢站立(rearing)次数、梳理(groo ming)次数及粪便颗粒数. 比较不同组间大鼠在新异环境中自发行为和探究行为表现的差异.1 . 3 . 2　Y -迷宫分辨学习(Y- maze discri minatio nlearning)能力检测Y-迷宫为三等分辐射式反射箱. 以大鼠被电击

后逃至安全区为一次正确反应,连续10次测试中有9次(90 %)正确反应,定为学会标准. 记录每个大鼠达到学会标准的训练次数. 所有检测过程均由计算机完成.

1 . 3 . 3　一次性被动回避反应(o ne- t rial passiveavoidance respo nse)根据大鼠趋暗习性,记录其在通道上的停留时间,即步入潜伏期(step- t hrough latency , S TL) ;动物进入暗箱后立即给予电击(0 . 3 mA ,5 s) ; 24 h 后检测大鼠的S TL .以S TL作为记忆保持的指标, S TL越长表明对电击的记忆保持越好. 检测以240 s为限.本实验数据用( X±SŠX( X表示,组间差异用t检验;一次性被动回避反应采用Mann- whit ney非参数检验

2　结 　　果

2 . 1　不同组大鼠开场行为观察结果见表1 ,统计处理表明,在开场行为诸参数中,D-gal +βA P组动物与N S + N S组比较粪便颗粒数有显著性差异( P< 0 . 05) ,而跑动格数则极明显减少( P< 0 . 01) ,前者在新异环境中自发活动和探究反应明显下降,紧张恐惧状态也降低. D-gal + N S组动物跑动格数与N S + N S组比较也有显著性差异( P< 0 . 05). N S + N S组与N S +βA P组之间虽无显著性差异,但其跑动格数、站立次数均有下降趋势,说明βA P单独使用对大鼠在新异环境中的自发活动及探究行为也有一定影响.

2 . 2 　Y-迷宫分辨学习能力检测

达到学会标准所需训练的次数, N S + N S 组:21 . 4±2 . 6 ;N S +βA P组:34 . 6±5 . 5 ;D-gal + N S组:42 . 4±5 . 4 ;D-gal +βA P组:48 . 0±5 . 6 . 前两者比较无显著性差异( P> 0 . 05) ,D-gal + N S组与N S + N S组比较有显著性差异( P< 0 . 05) ,而D-gal +βPA组与N S + N S组比较,达到学会标准所需训练次数极明显增加( P< 0 . 01) ,说明D-gal所致衰老模型大鼠的分辨学习能力显著降低,而在衰老动物模型上海马内注射βA P更使学习能力极显著下降.

2 . 3　一次性被动回避反应

D-gal +βA P组记忆保持能力明显下降,电击后24 hS TL显著缩短,与N S + N S组和D-gal + N S组比较有显著性差异( P< 0 . 05). 其他组之间比较,差异无显著性,但记忆保持能力呈逐渐降

低趋势

3　讨 　　论

有研究报道,对大鼠连续注射D-半乳糖引起拟

衰老效应

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,可导致动物学习记忆能力下降,脑内

超氧阴离子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶

(SOD)活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 这说

明D-半乳糖诱发的自由基蓄积引起的脂质过氧化

损伤,是产生拟衰老变化的原因,这必然也会引起衰

老性脑功能的衰退.βA P是老年性痴呆患者最早出现的典型的病理

学特征. 一些学者认为, βA P可引起学习记忆减退、认知障碍等是AD各种病理和临床表现的始发因素. βA P具有沉积作用和神经毒性,较高浓度的βA P能引起神经退化和死亡

;βA P的神经毒性作

用可以增强或加大各种伤害性刺激的细胞损伤效应,此外它还具有直接的细胞毒性

. 但Morimoto报道,在大鼠海马神经元,单独注射βA P不能产生特定的神经毒性作用,仅能引起少量的神经元变性. 无论在体外培养细胞,还是在体内研究中,βA P是否具有神经毒性作用还存在着争议,其原因可能是所用βA P的浓度不同所致

. 本研究结果

表明海马内单独注射βA P不能引起明显的行为学变化,但在衰老动物模型基础上经βA P处理后,可导致动物自发活动及学习记忆行为明显降低,说明D-半乳糖和βA P有叠加效应. 学习记忆是脑的高级功能,学习记忆减退是脑功能衰退的表现. 因此,本实验结果提示,在D-半乳糖所致衰老动物基础上,海马内注射βA P ,可望作为更接近AD的一种动物模型. 但它是否具有AD的各种病理学特征,还有待于做进一步研究