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果表明: (1)应激后ES1组的水平活动增加,与C1组比较,差异有显著性, p<0. 01; (2) ES1组海马和前脑皮层的NG磷酸化水平高于C1和C2组,差异有显著性,均为p<0. 05; ES2组的前脑皮层NG的磷酸化水平高于C1组,差异有显著性,为p<0. 05; (3)海马的NG磷酸化水平与水平活动之间的相关达显著水平。提示急性情绪应激能导致动物明显的行为改变如焦虑,这种行为改变可能与脑内NG磷酸化水平的变化有关。水平活动可能是反映急性情绪应激的较敏感行为指标,海马NG磷酸化水平可能是预测急性情绪应激所致焦虑或抑郁行为的较敏感生物学

指标。

关键词　急性应激,情绪应激,海马,前脑皮层,行为,神经颗粒素。

1　前言

　　迄今有关应激引起行为改变的脑机制,包括所涉及的物质分子、作用途径和信号传导方式所知甚少。以往的研究主要集中在神经递质和调质及功能的变化,也有用c - fos为探针进行相关脑区的探索,但在应激改变行为的脑机制的认识上仍有许多谜团。近年来,国内外许多学者认为突触可塑性的改变就是应激在中枢神经系统留下的生物学“痕迹”,它会引起脑功能和行为活动的改变。应激过程中,中枢突触可塑性机制的变化是涉及情绪和行为障碍发生的重要中枢机制,包括突触结构可塑性和突触功能可塑性机制的变化。前者是指相关脑区的神经元的数量减少和细胞缺失、树突棘萎缩等形态结构的器质性损害,其中海马和前脑皮层是涉及应激的最为重要的脑结构。后者则是指蛋白信号传导途径缺陷、突触传递效能障碍等,以中枢NR依赖性LTP的改变最受关注

　　由于中枢神经元特异性蛋白质及其磷酸化反应对维持突触结构和功能,包括突触的生长、发育、代偿性变化和功能传递均具有十分重要的作用。所以,应激后某些中枢神经元特异性蛋白质的含量和磷酸化水平变化,可能通过参与突触结构和功能可塑性机制的改变,涉及到应激所致行为效应的中枢机制。近期研究表明,某些表达于中枢神经元的蛋白质如热休克蛋白70(Heat Shockprotein- 70, HSP- 70)、脑源性神经营养因子(brainderivedneurotro2phicfactor,BDNF)、膜生长相关蛋白(thepresynaptic43- kDa growth- associatedprotein, GAP- 43),与应激和某些精神障碍发生密切相关,使得研究者们开始关注突触特异性蛋白质在应激反应的中枢机制中的可能角色。

　　神经颗粒素(Neurogranin, NG)是一种神经元特异性蛋白质,在与应激、情绪和行为密切相关的脑结构如皮质、海马和杏仁核中高表达,是突触后PKC的重要底物蛋白。研究发现,NG参与中枢NR依赖性LTP, PKC、PKA和CaMKⅡ等多种重要的蛋白信号传导途径,通过介导突触强度的改变,构成诱发突触可塑性表达的共同途径的一部分,在突触可塑性中具有关键作用。此外, NG能通过磷酸化水平的变化对中枢NR依赖性LTP过程产生明显的影响,对某些应激源的反应敏感,并且与学习记忆密切相关。因此,它可能涉及到应激所致行为障碍的突触结构和功能可塑性机制。研究发现,慢性生理应激和情绪应激能导致动物行为异常以及NG含量的显著下降,并且异常行为与NG含量的相关达显著水平。表明慢性应激后,NG含量下降是预测行为障碍发生的比较敏感的生物学指标,可能涉及慢性应激所致行为障碍的中枢机制。上述研究结果提示, NG可能作为一9: 00～9: 10和晚21: 00～21: 10给动物饮水,之后撤掉水瓶,其余时间不给水。定时喂水期结束后开始应激实验, ES组动物在定时喂水时间内给予的空

瓶刺激诱发其情绪应激,刺激的给予是无规律的,但维持一天一次;应激共持续3天。C1和C2组不接受任何处理,在笼中饲养,自由饮水和摄食。所有动物在适应期开始、适应期末、定时喂水期末、应激第3天共称四次体重以考察应激的程度。

2. 3　仪器和试剂

　　第一抗体抗NG总蛋白单克隆抗体、磷酸化NG多克隆抗体、β- Actin单克隆抗体、第二抗体辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、山羊抗鼠IgG抗体、BCA(bicinchoninicacid)蛋白检测试剂盒、全细胞裂解液(buffer)、硝酸纤维素膜(Nitrocellulosefilter,NC)均为Sigma公司产品,增强型化学发光系统(ECL)试剂盒购自美国Pierce公司。Gel. Doc凝胶成像半定量分析系统购自Bio- Rad公司。

2. 4　行为学测试

　　采用旷场测试和高架十字迷宫任务程序, ES1组和C1组动物在适应期末和应激期末共进行两次行为测试。

2. 4. 1　旷场测试　将动物置于高50cm、直径180cm、周边和底面均为黑色的圆形旷场中,光照度为60lux,室内隔音。观察者在行为实验室内用摄像系统记录动物在旷场内5min的行为表现,包括水平活动距离、直立、修饰、探究、呆滞和排便量。其中水平活动距离和探究通过行为跟踪分析系统获得数据,直立、呆滞、修饰行为是根据行为摄像仪统计发生的次数。每只动物的排便量是以旷场试验结束后排便的颗粒数来表示。2. 4. 2　高架十字迷宫任务　装置高50cm,开放吊臂为110cm×10cm×10cm(长×高×宽),闭合吊臂为110cm×50cm×10cm(长×高×宽)。测试于每天10∶00～14∶00h进行。在测试开始时,大鼠被放

至迷宫的中间平台上,面对迷宫的同一个开放吊臂。

测试时间为5min,记录4个行为指标。(1)进入迷

宫开放吊臂总次数, (2)在迷宫开放吊臂中停留时

间, (3)进入迷宫闭合吊臂总次数, (4)在迷宫闭合

吊臂中停留时间。

2. 5　海马和前脑皮层NG的测定

　　应激实验结束后次日,对ES1组和C1组大鼠进行行为测试后,立即快速断头处死所有大鼠,剥离海马和相同体积的前脑皮层组织,前脑皮层组织是根据大鼠脑图谱确定的正中线靠近前外侧的前额叶皮层组织(如图1所示M1和M2区域)。之后将组织迅速用液氮冷却。

　　采用Western印迹杂交法(Westernblotting)测定大鼠海马和前脑皮层的NG含量和磷酸化水平。将组织加入buffer匀浆。匀浆后加入BCA液摇匀,在37℃水浴箱中温育30分钟,通过蛋白质分光光度计进行样品海马和前脑皮层总蛋白质的初步定量,根据样品总蛋白含量计算出每一样品跑电泳所需加入的缓冲液量。匀浆中加入样品缓冲液,走15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至NC膜,NC膜以封闭液(10%脱脂奶粉,溶于TTBS)室温封闭1h,用Tris/Tween缓冲盐水(TrisbufferedTween- 20sa2line, TTBS)洗膜, 10min(3次。加入抗NG总蛋白单克隆抗体室温孵育3h,再用TTBS洗膜, 10min(3次。TTBS液稀释山羊抗兔IgG抗体(1: 4000)孵

育,室温,振荡1h,同样洗膜3次。加入ECL荧光标记,以胶片曝光显迹。之后,对同一张NC膜上的内参蛋白β- Actin和磷酸化NG进行杂交。通过Gel. Doc凝胶成像半定量分析系统对胶片上的NG蛋白、磷酸化NG和β- Actin蛋白条带进

3　结果

3. 1　体重

　　适应期开始、适应期末、定时喂水期末和应激期末,四组动物的体重总体比较差异无显著性(p>0105)。但在应激期内(从定时喂水期末到应激期末), ES1和ES2组动物体重增长非常缓慢。

3. 2　旷场行为测试

应激前,两组动物在旷场测试中水平活动距离、直立次数、修饰行为、呆滞行为和排便量的比较差异无显著性(p>0. 05)。　应激后, ES1组表现出水平活动增加,与C1组比较,差异有显著性(p<0. 01)。其余行为指标的比较差异无显著性。