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方法　通过Y迷宫训练,用52溴222脱氧尿嘧啶核苷(52bromo222deoxyuridine ,BrdU) 标记增殖细胞,用ABC 免疫细

胞化学方法观察成年大鼠海马齿状回细胞的增殖情况。结果　Y迷宫训练组海马齿状回BrdU 阳性细胞数明显多

于对照组( P < 0. 05) ,且Y迷宫训练成绩的优劣与海马齿状回神经细胞增殖的多少存在相关性,学习成绩良好组

齿状回BrdU 阳性细胞数显著多于学习成绩低劣组( P < 0. 05) 。结论　Y迷宫训练可促进成年大鼠海马齿状回神

经干细胞/ 前体细胞的增殖。

关键词: Y迷宫; 学习; 海马; 细胞增殖

　　近年的研究[1 ,2 ]表明:成年哺乳动物海马终生

存在神经发生(neurogenesis) ,其生发区位于海马齿

状回的颗粒下层( subgranular layer , SGL) 。成年海

马神经的发生受多种因素的调节,包括生理因素和

病理因素。促进神经发生的因素有丰富多彩的环

境、运动、癫痫等;抑制神经发生的有应激、衰老及5

- 羟色胺缺失等[3 ,4 ] 。学习记忆也能促进海马神经

发生。Gould 等[5 ]报道经典的条件反射及Morris 水

迷宫学习能促进海马齿状回新生神经元的存活。

Lemaire 等[6 ] 的研究表明,Morris 水迷宫学习能促进海马齿状回神经干细胞/ 前体细胞的增殖。目前

国内外有关学习记忆对海马神经发生的研究大多使

用Morris 水迷宫模型[1 ,5 ,6 ] ,用Y 迷宫模型的还未

见报道。因此,本研究探讨Y迷宫训练对海马神经

发生的作用。现报道如下。

1 　材料和方法

1. 1 　材料

1. 1. 1 　实验动物和分组　成年雄性SD 大鼠18

只,体重180～220 g ,苏州大学医学院实验动物中心提供。将动物随机分成对照组(动物置于Y迷宫内

自由活动,不施以电击和灯光指示,放置的时间和轮

次同训练组, n = 6) 和Y 迷宫训练组(每日训练3

轮,时间点为9∶00 、12∶00 、15∶00 ,每轮训练20 次,

连续3 d , n = 12) 。

1. 1. 2 　实验试剂　BrdU ,美国Roche 公司;BrdU

单克隆抗体, 美国Biosource 公司; 羊抗鼠二抗及

ABC(avidin2biotin complex ,ABC) 试剂盒,Vector 公

司;DAB 显色剂,美国Sigma 公司。

1. 2 　方法

1. 2. 1 　BrdU 标记　于第一轮和第三轮Y 迷宫训

练前1 h ,取BrdU 50mg/ kg , 溶于生理盐水,腹腔注

射2 次/ d ,间隔6 h ,连续3 d。第4 d 处死动物。

1. 2. 2 　学习记忆训练　Y 迷宫由3 个相同的臂组

成,分别称为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区。通常把下臂( Ⅰ臂)定为起步区,左侧( Ⅱ臂) 为安全区,右侧( Ⅲ臂) 为电

击区,三臂相交处为隔离区(0 区) 。迷宫底铺以铜

棒,可以通电刺激。三臂顶端各装有15W 的信号

灯。实验前先将大鼠放入迷宫,让其适应5 min ,训

练组大鼠在起步区予以电击致其逃至安全区,灯光

持续15 s ,然后熄灯休息45 s ,开始下一次操作。每

次实验在每只大鼠上重复20 次为一轮。实验在黑

暗、安静的环境中进行。凡大鼠受电击后10 s 内一

次性从起步区逃至安全区的反应称为“正确反应”,

否则为“错误反应”。以连续10 次电击中正确反应

达9 次或以上定为学会标准。达到学会标准所需的

电击次数表示学习记忆成绩,电击次数少说明学习

能力强。

1. 2. 3 　免疫组织化学检测　大鼠经4 %的水合氯

醛麻醉,开胸,左心室插管至主动脉,先快速灌流

0. 01mol/ L 的磷酸盐缓冲液( phosphate buffered

saline , PBS) , 再用4 %的多聚甲醛(paraformalde2

hyde , PFA) 缓慢灌流。取脑置于4 %的PFA 中固

定8 h 后,再转入20 %的蔗糖中过夜,从前囟后3. 3

～5. 1 mm 作连续冰冻切片,片厚30 μm ,隔2 张取

1 张。免疫组织化学ABC 法的步骤详见本实验室

以往的研究[7 ] ,简要步骤如下:脑片于4 mol/ L 的盐酸中室温下孵育30 min ;0. 1 %的胰酶37 ℃孵育10

min ;小鼠单克隆抗体BrdU 一抗室温下过夜( 1 ∶

200 ,Biosource) ;羊抗鼠二抗室温下孵育2 h (A/ B∶

200 ,Vector) ;DAB 显色5 min。各步骤间用0. 01

mol/ L 的PBS 漂洗3 次,每次5 min。常规封片,在

光镜下观察免疫反应阳性细胞,并计数和作显微摄

影。

1. 2. 4 　统计方法　每只大鼠随机选取4～5 张脑

片,光学显微镜下( ×400 倍) 计数每张脑片双侧海

马齿状回颗粒细胞层(granular cell layer , GCL) 、颗

粒下层及门区的BrdU 阳性细胞数。取每只大鼠4

～5 张脑片BrdU 阳性细胞的均数作为统计数据,以

均数±标准差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 软件作

方差分析,Excel 作数据处理并制成统计图。

2 　结果

2. 1 　学习记忆训练结果　12 只成年大鼠经过3 d

的Y迷宫学习训练后,所有大鼠均达到学会标准。

2. 2 　免疫组化检测结果　对照组成年大鼠海马齿

状回可见少量的BrdU 阳性细胞,分布在齿状回颗

粒细胞层、颗粒下层及门区,且大多位于海马齿状回

颗粒下层。BrdU 阳性细胞常聚集成丛,细胞核较

小,形态不一,呈圆形、椭圆形或无规则型(图1a) ;

海马齿状回BrdU 阳性细胞数为39. 37 ±2. 32 。训

练组大鼠海马齿状回的BrdU 阳性细胞亦分布在颗

粒细胞层、颗粒下层及门区,其中以颗粒下层增多最

明显(图1b、图1c) ;BrdU 阳性细胞数为57. 43 ±

11. 29 。两组的BrdU 阳性细胞数比较,有显著性差

异( P < 0. 05) 。

2. 3 　Y迷宫训练成绩优劣与海马齿状回细胞增殖

的关系　12 只成年大鼠进行Y迷宫训练后,达到学

会标准时电击次数的均数为40. 75 。学习记忆能力

优劣的判定,以每只大鼠达到学会标准时的电击次

数为依据。低于40. 75 ,列为学习成绩良好组( n =

6) ;高于40. 75 ,列为学习成绩低劣组( n = 6) 。免疫

组织化学结果显示,学习成绩良好组齿状回BrdU

阳性细胞数(65. 48 ±10. 51) 多于成绩低劣组(49. 38

±3. 49) ( P < 0. 05 ,如图2) 。再将每只大鼠Y迷宫

训练达到学会标准时的电击次数和齿状回BrdU 阳

性细胞数之间作相关分析,发现两者之间呈明显负

相关( r = - 0. 91 ,图3) 。说明齿状回BrdU 阳性细

胞数的增加与Y迷宫训练的成绩密切相关,训练成

绩越好,海马齿状回细胞增殖越多。

3 　讨论

海马与学习记忆密切相关。Y迷宫用于检测大

鼠空间辨别的学习记忆能力,大鼠在迷宫中对电刺

激出现被动逃避反应,经过多次训练后大鼠能学会

并记住迷宫安全区的空间位置。空间定位的记忆障

碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才

会出现。摘除双侧海马出现空间学习、记忆障碍,可1. 2. 4 　统计方法　每只大鼠随机选取4～5 张脑

片,光学显微镜下( ×400 倍) 计数每张脑片双侧海

马齿状回颗粒细胞层(granular cell layer , GCL) 、颗

粒下层及门区的BrdU 阳性细胞数。取每只大鼠4

～5 张脑片BrdU 阳性细胞的均数作为统计数据,以

均数±标准差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 软件作

方差分析,Excel 作数据处理并制成统计图。

2 　结果

2. 1 　学习记忆训练结果　12 只成年大鼠经过3 d

的Y迷宫学习训练后,所有大鼠均达到学会标准。

2. 2 　免疫组化检测结果　对照组成年大鼠海马齿

状回可见少量的BrdU 阳性细胞,分布在齿状回颗

粒细胞层、颗粒下层及门区,且大多位于海马齿状回

颗粒下层。BrdU 阳性细胞常聚集成丛,细胞核较

小,形态不一,呈圆形、椭圆形或无规则型(图1a) ;

海马齿状回BrdU 阳性细胞数为39. 37 ±2. 32 。训

练组大鼠海马齿状回的BrdU 阳性细胞亦分布在颗

粒细胞层、颗粒下层及门区,其中以颗粒下层增多最

明显(图1b、图1c) ;BrdU 阳性细胞数为57. 43 ±

11. 29 。两组的BrdU 阳性细胞数比较,有显著性差

异( P < 0. 05) 。

2. 3 　Y迷宫训练成绩优劣与海马齿状回细胞增殖

的关系　12 只成年大鼠进行Y迷宫训练后,达到学

会标准时电击次数的均数为40. 75 。学习记忆能力

优劣的判定,以每只大鼠达到学会标准时的电击次

数为依据。低于40. 75 ,列为学习成绩良好组( n =

6) ;高于40. 75 ,列为学习成绩低劣组( n = 6) 。免疫

组织化学结果显示,学习成绩良好组齿状回BrdU

阳性细胞数(65. 48 ±10. 51) 多于成绩低劣组(49. 38

±3. 49) ( P < 0. 05 ,如图2) 。再将每只大鼠Y迷宫

训练达到学会标准时的电击次数和齿状回BrdU 阳

性细胞数之间作相关分析,发现两者之间呈明显负

相关( r = - 0. 91 ,图3) 。说明齿状回BrdU 阳性细

胞数的增加与Y迷宫训练的成绩密切相关,训练成

绩越好,海马齿状回细胞增殖越多。

3 　讨论

海马与学习记忆密切相关。Y迷宫用于检测大

鼠空间辨别的学习记忆能力,大鼠在迷宫中对电刺

激出现被动逃避反应,经过多次训练后大鼠能学会

并记住迷宫安全区的空间位置。空间定位的记忆障

碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才

会出现。摘除双侧海马出现空间学习、记忆障碍,可见Y迷宫学习训练需要海马的参与,是依赖海马的

学习训练[8 ] 。

　　实验中,我们用52溴222脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)

标记增殖细胞。BrdU 是胸腺嘧啶核苷的类似物,当

细胞处于DNA 合成期(即S 期) ,掺入到新合成的

DNA 中,能较好地反映齿状回细胞的增殖情况。

本实验结果发现,未经Y迷宫训练的大鼠海马

齿状回内可见少量的BrdU 阳性细胞,且大多沿颗

粒下层聚集状分布,提示增殖细胞是由一个神经干

细胞/ 前体细胞分裂而来的。学习训练可以影响海

马的神经发生,Morris 水迷宫学习可促进海马齿状

回神经前体细胞增殖及存活[5 ,6 ] 。本实验结果显

示,Y迷宫训练组齿状回BrdU 阳性细胞数多于对

照组,其中以颗粒下层增多最明显。可见Y迷宫训

练能增加齿状回BrdU 阳性细胞数,促进海马神经

干细胞/ 前体细胞的增殖。

海马新生神经元参与了依赖海马的学习记忆形

成。跑步、丰富多彩的环境[3 ,4 ]能促进海马神经发生,提高水迷宫实验的成绩;长期应激[3 ,4 ]在抑制海

马神经发生的同时,降低水迷宫实验成绩。这些都

支持海马神经发生与空间学习能力相关的论点。本

实验结果表明:学习成绩的优劣与海马齿状回神经

发生存在相关性,学习成绩良好组齿状回BrdU 阳

性细胞多于成绩低劣组。Ambrogini 等[9 ]也报道过

类似的结果,他们发现Morris 水迷宫学习成绩与海

马齿状回神经发生直接相关,成绩良好的大鼠齿状

回BrdU 阳性细胞多于成绩低劣的大鼠。

至于这些新生细胞的分化前景,有待今后进一

步探讨。