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( nNOS)免疫阳性细胞数目的影响。方法　80只SD大鼠,随机分为睡眠剥夺组( SD) 、空白对照组(CC) 、环境对照组( TC) 。其中

睡眠剥夺组包括睡眠剥夺1、3、5、7 d,恢复睡眠6、12、24和48 h 8个时点。用改良多平台睡眠剥夺法进行REM睡眠剥夺,利用Y

迷宫测定大鼠学习记忆能力、运用免疫组织化学观测神经元型一氧化氮合酶阳性细胞表达变化。结果　同空白对照组及环境对照

组比较,所有睡眠剥夺组大鼠学习记忆能力均下降,而睡眠剥夺时间越长,学习记忆能力下降越明显,皮质nNOS阳性细胞数目越

多。随睡眠恢复时间延长, nNOS阳性细胞数目逐渐减少,学习记忆能力提高。结论　REM睡眠剥夺能够导致学习记忆能力下降,

其机制与一氧化氮合酶增高分解产生的一氧化氮增多对神经的毒性作用有关。

[关键词] 　睡眠剥夺;睡眠;记忆;一氧化氮合酶

　睡眠剥夺是指由于某些原因导致的睡眠数量减

少或睡眠质量下降。睡眠剥夺对人体的影响十分明

显:睡眠剥夺可以引起躯体疲劳、作业能力降低、免疫

功能下降、警觉水平降低,并引起情绪改变,精神不振、

粗心、注意力不能集中、食欲下降、记忆力下降、工作效

率降低等不良反应。长时间睡眠剥夺可引起实验动物

死亡。本研究REM睡眠剥夺对大鼠学习记忆能力的

影响, 研究与学习记忆密切相关的一氧化氮合酶

(NOS)在REM睡眠剥夺不同时点的变化,同时通过迷

宫试验测量不同时点睡眠剥夺后学习记忆能力的改1　材料与方法

1·1 　实验动物　成年雄性Sp rague2Dawley大鼠80

只,重250～300 g,清洁级。由上海第二医科大学实验

动物研究中心提供。

1·2 　实验仪器　MG2Ⅱ型迷宫、H86 漩涡混合器、

TGL18台式高速冷冻离心机、MP120电子天平、LXJ2Ⅱ

离心沉淀机、玻璃匀浆器、电热恒温水浴箱、Leitzl400

切片机、HP IAS21000图像测量分析系统等。

1·3　药物与试剂　Rabbit Anti2NOS1、即用型SABC

免疫组化染色试剂盒、DAB 显色试剂盒(博士德生物

工程有限公司) 。

中国医师杂志 　2007年 1月 　第 9卷第 1期 1

3 基1·4　动物分组及喂养　本实验于2002年8月在长

征医院神经内科实验室进行。先将大鼠进行“Y”迷

宫[ 1, 2 ]训练4～7 d,取达到标准(具体标准见后)的大

鼠,将大鼠随机分为2组,分别为睡眠剥夺组( SD组,

n = 40)和对照组( n = 40) 。睡眠剥夺组包括睡眠剥

夺1、3、5、7 d、睡眠剥夺7 d后恢复睡眠6、12、24、48 h

八个时点,每个时点5只大鼠。分别编号、称重,对照

组分为空白对照组(CC, n = 20)和环境对照组( TC, n

= 20) 。

1·5　睡眠剥夺模型的建立　采用改良多平台睡眠剥

夺法(MMPM)建立REM睡眠剥夺模型。制作长110cm、宽60 cm、高40 cm的水槽,其中放置15个直径为

615 cm,高810 cm的平台,平台间间隔15 cm,在平台

周边注满水,水温保持在22℃左右,水面距平台面约

110 cm,大鼠在平台上可自行饮食饮水,并可在平台间

活动。当大鼠进入REM睡眠时,由于全身肌肉张力降

低,节律性地垂头触水而觉醒,从而使动物始终不能进

入REM睡眠。实验在神经内科动物睡眠研究实验室

进行,室内温度控制在2210～2410℃, 40 W日光灯照

射08: 30～20: 30。实验前将各组大鼠放在同1笼中饲

养2周,实验前1周将大鼠放在平台上适应,每天适应

1 h。睡眠剥夺从08: 00开始,睡眠剥夺期间灯光持续

照射,水糟中的水每天更换。TC组采用与SD组大小

一样的鼠箱,但在其底部并不放置平台,而是放置一面

细密铁丝网,把大鼠放在网上,网下置水至离网格1

cm,以形成与SD组相似的环境。其它条件均与SD组

相同。CC组为放在一起饲养2周,未进行任何处理的

大鼠,饲养条件与SD组、TC组均相同。1·6　取材　各组动物在相应时点处死,用于免疫组

化的实验动物先予以10%水合氯醛( 30 mg/kg)腹腔

内注射麻醉,开胸经左心室至升主动脉插管,先以100

ml生理盐水冲洗血液,随后用冷的(4℃)含4%多聚甲

醛的011 mol/L磷酸盐缓冲液( PB, pH 714)先快后慢

灌流固定。2 h后取脑置于30%蔗糖中。

1·7　认知功能测试　⑴MG22型“Y”迷宫设置参数

电刺激参数是:电压50～70 V,延时2～5 s。⑵测试指

标　正误判定的标准:大鼠在足底通电后10 s内一次

性跑向安全区为正确反应,否则为错误反应,向所在的

起步区逆向逃窜也应归为“错误反应”; 错误次数

(EN) :系每天训练中出现错误反应的次数,一般训练

20次/d,该指标反映大鼠反应的正确程度;全天总反

应时间( TRT) :动物的反应时间(潜伏期)指从信号灯

亮开始至大鼠第1次逃至灯亮区为止所耗的时间,全

天总反应时是一个实验日(全天)完成所有反应(包括正确反应和错误反应)所需时间,该指标反映大鼠反应

时间的长短,可综合评价大鼠的学习记忆能力。⑶训

练方法　采用随机休息法,安全区以无规则次序变换,

以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。以大鼠

所在支臂就作为测试的起点,大鼠受电击后逃到安全

区后,灯光继续作用10～15 s,熄灯后结束一次测试,

两次测试时间间隔为30 s或休息1 min后、再予以第2

次测试,依次重复。固定训练20次/d,连续训练3～4

d。⑷认知功能障碍的标准及计算　规定大鼠受电击

后从起步区直接逃至安全区为“正确反应”,大鼠学习

记忆成绩以其测试达到连续10次中有9次(9 /10)正

确反应时所需的电击次数表示。达9 /10正确反应标

准所需电击次数多少表示大鼠认知功能的优劣。

1·8　免疫组化染色　运用ABC法,苏木素轻度复

染,脱水,透明,封片,显微镜观察。

1·9　定量分析计数　分别选择3个相邻视野,在40

倍光镜下采用标准网格对免疫反应阳性产物进行计

数,以“个/mm2 ”为单位,取3个视野的平均值。以阳

性细胞数除以相应的面积,得出阳性反应细胞的面积

密度(NA) ,每个标本取3张切片的均值供分析。

1·10　统计学处理　用SPSS软件,计数资料用.x ±s表示,差异显著性检验用t检验分析。

2　结果

2·1　睡眠剥夺后大鼠行为和生理变化[ 3 ] 　睡眠剥夺

7 d行为的变化尤其明显,表现为大鼠兴奋性提高,探

究行为和攻击性增强,对环境刺激的警觉性、反应性及

进攻行为也增强。睡眠剥夺7d生理改变明显,大鼠饮

食量增加、能量消耗增加、体重下降。表现疲惫不堪、

皮毛蓬乱、无光泽,尾巴和爪子的底表面也有损害。在

预实验中观察到睡眠剥夺7 d以后有个别大鼠死亡。

睡眠剥夺7 d后恢复睡眠12 h上述表现大多消失,所

有大鼠均出现睡眠增加。

2·2　学习记忆测定　睡眠剥夺前各组学习记忆能力

基本一致( P > 0105) 。正常对照组和环境对照组自

始至终均未出现学习记忆障碍,而睡眠剥夺组随剥夺

时间的增加,所需电击次数较对照组明显增加( P <

0101) ,出现学习记忆障碍,随睡眠剥夺后恢复时间延

长,学习记忆能力提高。见表1。2·3　免疫组化染色　各组切片经nNOS免疫组织化

学染色后, nNOS免疫阳性细胞呈棕黄色。与对照组比

较, REM睡眠剥夺组大鼠皮质nNOS免疫阳性细胞均

明显增多,各组皮质nNOS阳性细胞的NA。REM睡眠

剥夺组的NA显著高于环境对照组和空白对照组( P

< 0101)见表1。表1　大鼠Y型迷宫学习记忆成绩及皮质nNOS免疫

阳性细胞NA值　　( .x ±s )

　组别例数电击次数　　皮质NA值　　

　空白对照组20 　　12. 65 ±2. 37 　　　25. 6 ±4. 5

　环境对照组20 　　12. 67 ±2. 17 　　　28. 5 ±3. 4

　睡眠剥夺1d 5 　　20. 15 ±4. 10 　　　39. 6 ±2. 8▲

　睡眠剥夺3d 5 　　29. 68 ±5. 34▲ 　　　45. 7 ±3. 2▲

　睡眠剥夺5d 5 　　49. 31 ±5. 23▲▲ 　　　54. 3 ±1. 8▲▲

　睡眠剥夺7d 5 　　56. 67 ±4. 66▲▲ 　　　57. 9 ±3. 6▲▲

　睡眠剥夺恢复6h 5 　　45. 88 ±6. 47▲ 　　　53. 2 ±3. 8▲▲

　睡眠剥夺恢复12h 5 　　36. 53 ±3. 18▲ 　　　45. 4 ±4. 1

　睡眠剥夺恢复24h 5 　　20. 85 ±6. 44 　　　32. 3 ±3. 6

　睡眠剥夺恢复48h 5 　　18. 57 ±3. 20 　　　25. 1 ±2. 3

　　注:与对照组比较▲P < 0105; ▲▲P < 0101

3　讨论

睡眠是机体的正常生理需要,睡眠一旦被剥夺,则

会对机体产生相应的生理和心理影响,并会导致行为

失常以及疾病的发生。睡眠能增强大鼠的学习能力,

对于学习复杂事物的巩固化也是非常必要的。睡眠

时,一种细胞激活素的基因在大脑中活性提高,能改善

突触传递,增强对获取的信息进行处理和加工、形成记

忆的能力。研究发现,在整个睡眠阶段中, REM睡眠

对学习和记忆的影响更大[ 4 ] 。在学习较复杂的知识或

完成较多的任务后, REM睡眠数量增加比较明显;而

在完成简单任务或学习简单知识后, REM睡眠数量增

加并不多。探索学习记忆的原理与规律可以阐明以学

习记忆障碍为表现的睡眠障碍的机制和寻找其有效防

治的手段[ 5 ] 。一氧化氮(NO)作为中枢神经系统细胞间信使分子[ 6 ] , 在学习记忆机制中具有重要作用。

NOS是催化产生内源性NO的唯一酶类,NO作为神经

系统全新的信号物质,以其独特的逆行信使作用参与

了与突触可塑性及学习记忆有关的长时程增强(LTP)

机制[ 7, 8 ] 。NOS抑制剂可以阻断LTP,表明NO为LTP

形成所必需。现已明确NO作为逆行信使介导LTP的

通路和机制。NO在突触后产生并弥散出神经元,逆向

运行至突触前以及周围相关神经元,透过细胞膜活化

鸟氨酸环化酶,使cGMP水平升高,促进神经递质(如

谷氨酸等) 释放, 谷氨酸作用于突触后NMDA 及非

NMDA受体,钙离子内流流入突触后,与钙镁一起激活

NOS,又产生NO,从而诱导和维持LTP过程。NO是近

年来被认识的一种特殊神经递质,它既是学习记忆过

程的关键信号,又能产生严重的神经损伤。NO与海马

长时程增强的形成有关[ 9 ] 。NO是由L2精氨酸和分子

氧在3种不同的一氧化氮合酶催化下生成的。根据酶的细胞或组织来源不同,将其分为3型:神经元型NOS

( nNOS,NOS21) 、免疫型NOS ( iNOS, NOS22)和内皮细

胞型NOS ( ecNOS, NOS23 ) ,从功能上讲, nNOS和ec2

NOS属于原生型( cNOS) , iNOS属于诱导型( iNOS) 。

目前公认, ecNOS 产生的NO 有神经保护作用, 而

nNOS和iNOS产生的NO则有神经毒性作用。

本实验发现,同对照组比较,所有睡眠剥夺大鼠学

习成绩均下降,随睡眠剥夺时间越长,大鼠学习能力下

降越明显。睡眠剥夺时间延长,导致神经元型一氧化

氮阳性细胞数明显增多,催化产生高浓度的NO,高浓

度NO具神经毒性作用表现在它能诱发氧化应激,抑

制线粒体功能,干扰能量代谢,损伤DNA或导致DNA

突变,使胞液Ca2 +升高,激活大量途径损害细胞,诱导

细胞凋亡[ 10 ] 。过高的NOS也具有神经毒性作用。本

实验表明,睡眠剥夺组与睡眠剥夺后恢复睡眠组比较,

睡眠恢复可以改善学习记忆能力,减少电击次数,降低

神经元型一氧化氮合酶阳性细胞数。证明及时恢复睡

眠可以防止睡眠剥夺后的学习记忆损害,其机制可能

与改善细胞内的代谢紊乱,从而改善学习记忆障碍。

本实验也显示,睡眠恢复并不能完全抑制睡眠剥夺所

致的神经元性一氧化氮合酶阳性细胞增多和阻止LTP

损害,说明睡眠剥夺后的学习记忆障碍的机制十分复

杂,并不是单一机制发挥作用。对于睡眠剥夺对学习

记忆及脑神经功能的研究有待于进一步深入。