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慢性癫痫对大鼠空间记忆再生能力的影响

资料来源：http://www.bio-will.com/pdlistone/tech/739377.html

[摘　要]　目的: 探讨慢性癫痫对大鼠空间记忆再生能力的影响, 检测组胺前体物质组氨酸和胆碱酯酶抑制剂TA K2147 对癫痫诱发记忆障碍的作用。

方法: 大鼠在放射状八臂(四臂放食物)迷宫训练成功后, 隔日腹腔注射亚惊厥剂量(35mgö kg)的戊四唑, 直至完全点燃。完全点燃后在同一迷宫中测记忆的再现过程。

结果: 完全点燃后第1 d 至第 18 d, 大鼠在放射状迷宫中的错误次数较对照组明显上升, 且维持在一相对平衡的状态, 31 d 后与对照组一致。TA K2147 剂量依赖性地改善了癫痫诱发的空间记忆再现障碍, 包括参考记忆和工作记忆。组氨酸剂量依赖性地改善参考记忆, 不影响工作记忆。

结论: 戊四唑点燃癫痫可导致大鼠空间记忆再生能力下降, 可能与癫痫造成的胆碱能神经和组胺能神经活性降低有关。

[关键词]癫痫/化学诱导，放射状迷宫，记忆障碍，胆碱酯酶抑制剂/药理学，组氨酸/药理学

癫痫所造成的危害不仅在于癫痫发作本身, 还在于反复发作的慢性癫痫所致的智能障碍。有报道称, 45%的癫痫患者有记忆障碍等行为异常, 10%～ 20%的癫痫儿童需要特殊的教育[ 1 ]。因此, 研究癫痫造成学习记忆障碍的机制和筛选治疗这种学习记忆障碍的药物较为迫切。戊四唑(PTZ)是一种中枢兴奋剂, 反复使用亚惊厥剂量的戊四唑, 可以使动物的惊厥阈值降低, 最后造成“点燃”。戊四唑点燃模型是一种慢性癫痫模型, 常被用来研究癫痫的发病机制和抗癫痫药物的效果, 是最常用的癫痫模型之一[ 2, 3 ]。放射状八臂(四臂放食物)是一种经典的测定动物空间记忆的方法, 它可以同时检测动物的参照记忆( reference m emo ry)和工作记忆(wo rk ing m emo ry)。为此, 本实验用放射状迷宫测定戊四唑点燃大鼠的空间记忆再现的方式, 研究癫痫与学习记忆的关系和机制,并初步评价了两种被认为能改善记忆障碍的化合物TAK2147和组氨酸, 为治疗癫痫患者的记忆损害提供线索。

1　材料和方法

1 . 1　动物和分组　SD大鼠50只, 雄性, 体重220～300g (浙江大学医学院实验动物中心提供) ,清洁级Ê级, 证书号: 2229601018。将 SD大鼠随机分成PTZ 点燃组(n= 40)和对照组(n=10) , 并分笼分组饲养, 自由进水, 每天给12h的光照(光照时间: 8∶00～20∶00)。在进行八臂迷宫实验前限制大鼠饮食, 使其体重维持在自由进食体重的80%～85%。行为学观察在10∶00～ 17∶00 进行。

1 . 2　迷宫训练　采用放射状八臂(四臂放食物)迷宫。迷宫中央区直径30cm , 向四周以等角度和等长度延伸八条臂(50cm×12cm , 围以4.5cm高的墙)。整个迷宫高出地面40 cm。训练前大鼠先在迷宫中适应2 d, 每天1次。适应时3至4只大鼠同时置于迷宫中, 自由活动和摄取食物10min。适应后进行每天1次的训练。每次训练中, 八臂中只有四臂放置了食物(分别为 3、5、6 和8号臂) , 整个实验过程均维持此顺序。大鼠放在迷宫中央区, 此时中央区四周用门关住 15 s 将门打开, 大鼠可选择进入任意一臂, 以摄取食物。大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为1 次正确选择, 否则为错误选择。记录参数为错误选择的次数。重新进入放食物臂称为工作记忆错误(wo rk ing m emo ry er ro r,WM E) , 进入不放食物臂称为参考记忆错误( reference m emo ry er ro r, RM E)。连续5 次训练总错误选择次数为 1 次或 1 次以下, 认为训练成功。

1 . 3　戊四唑点燃模型　迷宫训练成功后, 戊四唑点燃组大鼠腹腔注射PTZ35mgökg,48h1次,非点燃组腹腔注射同样体积的生理盐水。每次注射后, 大鼠单独放在透明的玻璃笼子里, 观察行为变化30min。癫痫发作严重程度根据文献[2,3]分级: 0= 无反应;1=耳朵和面部抽动, 包括眨眼,动须,节奏性咀嚼;2=肌阵挛, 但无直立;3=肌阵挛, 两前肢抬起;4=侧身倒地; 5=背部倒地,全身强直-阵挛发作或死亡。若动物连续3 次注射PTZ 后发作级别达4级或5级,则认为完全点燃。大鼠完全点燃后24 h开始测记忆的再现过程, 整个测定过程参照物体和放食物臂同训练过程一致。

1 . 4　药物　戊四唑和组氨酸购自 Sigm a 公司, TA K2147 由日本武田制药公司提供。所有的药物均溶于生理盐水。组氨酸和 TA K2147分别在记忆测试前 2 h 和30 m in 腹腔注射。

1 . 5　统计学处理　采用 Sigm a Stat 1. 01(W indow s 95 1992, Co rp ,U SA )统计学软件进行数据的分析处理。数据均以xq±s 表示。组间比较用ANOVA及Dunnet t’s检验。

2　结　果

2 . 1　完全点燃后1d、7d、11d、16d和18 d,RME分别为: 215±015、218±015、218±015、218±017和219±016;WME分别为:116±014、118±015、210±016、119±016和118±015,与对照组相比明显增加(P<0105),且维持在一相对平衡的状态, 适合测试药物效果。 18d后上述指标开始下降, 至31d基本和非点燃组持平,如完全点燃后23d和31d,RME分别降为210±016和113±016,WME分别降为018±013和015±014。而对照组的RME和WM E分别自始至终保持在111±016～113±015和012±012～013±012之间。

2.2　在完全点燃后1～18d测TAK2147对记忆再现的作用。TA K2147剂量依赖性地减少了RM E。如表1 所示, 013m gö kg 的TA K2147 使RM E 和WM E 均显著减少 (P < 0105) , 011m gö kg 的TA K2147 也使RM E 显著减少(P <0105)。

2.3　在完全点燃后1～18d测组氨酸对记忆再现的作用。组氨酸(1 000m gö kg)可以显著性地减少 RM E (P < 0105) , 却不影响WM E。

3　讨　论

本实验发现, 戊四唑点燃使训练成功的大鼠在放射状八臂迷宫的错误选择次数(包括RM E 和WM E)明显增多, 并且在完全点燃后1至18 d 内保持在一相对稳定的状态。有关癫痫大鼠学习记忆的研究, 电点燃模型的研究较多,用化学点燃模型者少见。与电点燃模型相比, 戊四唑化学点燃模型具有制作方便、成功率高、不破坏脑组织结构等优点。另外, 戊四唑是一种GABAA 受体的拮抗剂, 其本身对记忆无明显影响。本实验结果表明, 大鼠戊四唑点燃有希望成为研究癫痫诱发学习记忆障碍的模型, 并用于评价和筛选治疗癫痫诱发的认知功能障碍的药物。乙酰胆碱对学习的获得和记忆的保持都至关重要。Ser ra 等报道戊四唑点燃使自由活动的大鼠海马中乙酰胆碱含量下降至对照组的52%,并维持这水平达4周, 至停止戊四唑注射后30d 恢复至对照组水平[7]。我们的行为学结果与Ser ra 的生化结果具有时间的一致性, 这提示慢性癫痫诱发的记忆障碍可能与脑内乙酰胆碱含量下降有关。TAK2147是一种选择性较强的胆碱酯酶抑制剂, 可以活化脑内胆碱能神经。我们发现TA K2147 的作用可能正是在于它改善了点燃造成的海马乙酰胆碱功能的低下, 从而改善了戊四唑点燃诱发的大鼠空间记忆再现障碍。

此外, 脑内组胺也被认为可以改善学习记忆, 组胺的作用与激活脑内组胺H1 受体和活化胆碱能神经有关[ 8 ]。目前虽无戊四唑点燃与脑内组胺含量关系的报道, 但已经报道杏仁核电刺激至完全点燃, 停止电刺激后 1 周脑内组胺含量下降, 1 个月后恢复至点燃前水平[ 9 ]。组胺前体组氨酸可以增加脑内组胺含量。组氨酸可能通过增加脑内组胺含量激活组胺H1 受体和ö 或活化胆碱能神经, 改善戊四唑点燃诱发的大鼠记忆再现障碍。我们曾报道组胺可以抑制戊四唑点燃癫痫的形成过程和点燃后的发作过程, 因此, 组胺的相关药物可能成为较好的抗癫痫药或治疗癫痫的辅助药。而且有趣的是, 组氨酸仅对参照记忆有改善作用, 对工作记忆没有效果, 这一结果也进一步证实了我们先前的结果, 即内源性组胺对参照记忆和工作记忆的作用出现分离。综上所述, 大鼠戊四唑点燃造成了空间记忆再现障碍, 可能跟点燃造成的胆碱能神经和组胺能神经活性降低有关, 其具体机制还需要做进一步的探讨。我们的研究结果给癫痫与认知功能的关系研究和癫痫诱发记忆障碍的药物治疗评价, 提出了新的思路和线索。