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瑞香狼毒提取物抗实验性癫痫筛选研究

资料来源：http://www.bio-will.com/pdlistone/tech/713349.html

【摘　要】　目的　对瑞香狼毒六种提取物(依次为瑞香狼毒水、生离物、丙酮、石油醚、乙迷、乙醇提取物)进行药效学及毒性比较研究, 筛选出一种高效低毒的抗癫痫化合物, 便于临床前机制探讨。方法　采用动物三种惊厥模型, 测定瑞香狼毒六种提取物抗实验性癫痫半数有效量(ED50)。计算其半数致死量(LD50)。结果　瑞香狼毒提取物Ë～ Î , 即丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四种提取物对小鼠最大电休克发作实验(M ES)、戊四唑惊厥实验(M ET)和电刺激大鼠皮层惊厥阈值(TL S)模型均具有较强的对抗作用。而其中丙酮提取物毒性较低, 治疗指数高达 1419。结论　瑞香狼毒丙酮提取物是一种抗惊厥作用较强而毒性小的有希望的抗癫痫化合物。

【关键词】　癫痫，瑞香狼毒，提取物，筛选

自发现狼毒大戟碱性提取液具有较强的抗惊厥、抗癫痫作用以来, 又进一步对瑞香狼毒(Stellera cham aejasm e L. , 为瑞香科植物; 药用其根 radix stellerae)进行了大量基础研究, 发现瑞香狼毒具有更强的抗惊厥、抗癫痫活性, 但迄今为止,尚未见抗惊厥、抗癫痫方面的报道。本文通过瑞香狼毒六种提取物抗实验性癫痫作用半数有效量(ED50)及测定其半数致死量(LD50) , 筛选出高效低毒化合物丙酮提取物, 便于进一步临床前机制研究。

1　材　　料

111　动物: 昆明种小鼠 660 只, 6～ 8 周龄, 体重(22±4) g,雌雄皆用。雌性大鼠72 只, 3～ 4 个月龄, 体重(180±20) g,皆由本校实验动物中心提供。

112　药品及配制: 瑞香狼毒水、生离物、丙酮、石油醚、乙迷、乙醇六种提取物(提取物: É～ Î )均由沈阳药科大学提供。实验前水提物、生离物、丙酮提取物用蒸馏水配制; 石油醚、乙迷、乙醇提取物用蒸馏水加 2%吐温 013 mL 配成不同浓度混悬液。戊四唑(met razo l)由荷兰癫痫研究中心惠购, 实验前用蒸馏水配成所需浓度。

113　仪器: 最大电休克惊厥实验用电惊厥仪; 电刺激大鼠皮层惊厥阈值测定采

用惊厥阈值自动测定仪。

2　方　　法

211　抗实验性癫痫作用

21111　最大电休克惊厥实验(maximal elect ro shock seiz2ure test,M ES) : 采用Sw inyard 法稍加改良。用两个耳电极夹住动物两耳尖部, 然后通以 8 Hz, 110 V 交流电刺激 013s, 以后肢强直与否为观察指标[1 ]。实验前 24 h 筛选动物,凡刺激未见后肢强直或反应不明显小鼠弃之不用。将合格小鼠分为 5 组, 每组 10 只, 分别腹腔注射不同剂量同一待测提取物混悬液, 2 h 后测定其抗M ES 效应, 以B liss 法计算瑞香狼毒六种提取物抗M ES ED50值及 95%可信限。

21112　戊四唑惊厥实验(met razo l seizure test,M ET ) : 将合格小鼠分为 6 组, 每组 10 只, 其中 5 组分别腹腔注射不同剂量同一待测提取物混悬液, 正常对照组腹腔注射等容量蒸馏水加2%吐温, 2 h 后腹腔注射戊四唑100 mgö kg, 以待测提取物能否防止戊四唑引起的全身阵挛性惊厥为指标, 观察5m in。正常对照组小鼠注射戊四唑后50 s 内全部出现阵挛性惊厥。计算六种提取物抗M ET ED50及95%可信限。

21113　电刺激大鼠皮层惊厥阈值测定 ( th resho ld fo rlocalized seizure, TL S) : 将实验大鼠乌拉糖5 mLö kg 腹腔注射麻醉后固定于动物脑立体定位仪上, 施行无菌手术。按照Vo skuyl 等[2 ]实验方法, 将两根直径112 mm 不锈钢电极植入脑两侧额叶皮层运动区, 牙托水泥固定。术后1 周采用电刺激惊厥阈值自动测定仪测定大鼠惊厥阈值。刺激参数: 单向斜坡梯形双极脉冲; 波宽2 m s; 强度15 s 内从0～ 1 000 L A , 每日定时刺激2 次, 使大鼠出现前肢痉挛或面部颤动和半侧躯体痉挛时立即停止刺激, 以此刺激强度(L A )为惊厥阈值。连续刺激1 周, 惊厥阈值稳定后用于实验。实验分3 组, 每组6只, 均刺激3 次, 取其均值为药前惊厥阈值。之后分别腹腔注射不同剂量(原生药剂量相同)同一待测提取物Ë～ Î 混悬液, 药后2 h 按药前相同参数刺激, 记录其升高阈值。

212　LD50测定

将健康小鼠分 5 组, 每组 10 只, 腹腔注射不同剂量同一待测提取物混悬液, 观察 24 h 小鼠死亡数。B liss法计算瑞香狼毒提取物Ë～ Î LD50。

213　统计学方法

结果用x q±s 表示, 实验数据采用u 检验、析因分析。

3　结　　果

311　抗M ES 效应(ED50) : 见表1。瑞香狼毒六种提取物中丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四种提取物均能有效对抗小鼠M ES, 且对M ES 具有剂量依赖性对抗作用。

312　抗M ET 效应(ED50) : 见表1。瑞香狼毒六种提取物中丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四种提取物对M ET 亦有不同程度的对抗作用, 且对M ET 具有剂量依赖性作用。

313　抗 TL S 效应: 提取物Ë , 剂量为 60、 90、 120 mg 的升高阈值分别为 141±49、 256±83、 305±81; 提取物Ì , 剂量为 500、 750、 1 000 mg 的升高阈值分别为 141±49、 198±70、 244±62; 提取物Í , 剂量为 160、 240、 320 mg 的升高阈值分别为 168±79、 305±90、 277±119; 提取物Î , 剂量为400、 600、 800 mg 的升高阈值分别为152±45、 136±89、 261±94。四种提取物的中剂量组与低剂量组比较P < 0101, 高剂量组与低剂量组比较P < 01001。四种提取物亦能提高大鼠TL S, 且同一提取物呈量2效正相关。

314　LD50测定: 见表1。四种提取物中, 丙酮提取物毒性较低, 其LD50与石油醚、乙迷、乙醇提取物相比差异有统计学意义(P < 0101) , 治疗指数高达 1419。

4　讨　　论

本实验首次发现瑞香狼毒具有抗癫痫活性。药效学实验结果表明, 瑞香狼毒六种提取物中, 丙酮、石油醚、乙迷、乙醇四种提取物均能有效对抗小鼠最大电休克惊厥发作, 对戊四唑惊厥亦有不同程度的对抗作用。四种提取物亦能提高电刺激大鼠皮层运动区诱发惊厥的惊厥阈值, 且同一提取物呈量2效正相关, 进一步肯定了其抗惊厥作用。毒性试验(表 1)显示了四种提取物中, 丙酮提取物毒性较低, 其LD50与石油醚、乙迷、乙醇提取物相比差异有统计学意义(P < 0101)。治疗指数高达1419。

以上结果充分表明, 瑞香狼毒为一有希望前途的中草药, 有望通过高科技手段对该药有效抗癫痫成分丙酮提取物进一步分离提取, 分析其化学结构, 为定向半合成抗癫痫新药奠定物质基础和提供理论依据。