来宝网 2012/12/3点击1897次
重组人胰岛素的制备—下游纯化工艺的研究
摘要 建立了一套通过大肠杆菌表达(H is) 6
2A rg2A rg2人胰岛素原[ (H is) 6
2A rg2A rg2human p ro insulin,
RRhP I]制备重组人胰岛素的工艺。将大肠杆菌中以包涵体形式表达的RRhP I 依次经过DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析, Sephadex G225 层析, 重组复性酶切转化和Superdex75 分子筛, 制备重组人胰岛素。SDS2PA GE、HPLC、氨基酸组成分析和小鼠惊厥实验结果证明, 制备的重组人胰岛素具有天然生物活性, 而且纯度较高。
关键词 重组人胰岛素 纯化 DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂 Superdex75
1 引 言
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环, 这是由于工程菌经过大规模培养后, 产生的有效成分含量很低, 杂质含量却很高; 另外由于基因工程药物是从转化细胞, 而不是从正常细胞生产的, 因此对产品的纯度要求也高于传统产品。所以要得到合乎医用要求的基因工程药物, 分离纯化要比传统产品困难得多。在重组人胰岛素(Recom b inan t hum anin su lin, rh I) 的基因工程生产中, 同样面临着下游处理非常复杂的问题。为了能有效地纯化目的产物, 目前基因工程生产中普遍使用的是亲合层析和HPLC等手段, 这些分离纯化技术虽然分辨率高, 特异性强, 但十分昂贵。不利于降低成本。为了降低生产成本, 本研究建立了一套由(H is) 62A rg2A rg2人胰岛素原[ (H is) 62A rg2A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ] 制备重组人胰岛素的下游纯化工艺, 并对产品的性质和纯度进行了鉴定。
2 材料与方法
2. 1 工程菌
RRhP Iö pQ E240 大肠杆菌M 15 菌株。
2. 2 主要试剂
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂, Sephadex, Superdex75, 胰蛋白酶和羧肽酶B, 低分子量蛋白, 人胰岛素, 谷胱甘肽(氧化型和还原型),DTT, 其它化学试剂均为国产或进口飞行纯。
2. 3 RRhP I 的初步纯化
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析柱用30mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 平衡, 包涵体用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, 50mmo löL DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合适的氯化钠梯度进行洗脱, SDS2PA GE 确定RRhP I 组分, 收集含RRhP I 的洗脱液。2. 6 复性及酶切转化将初步纯化后的RRhP I 在Sephadex G225 层析柱上脱尿素, 转换缓冲液进行重组复性, 然后用胰蛋白酶和羧肽酶B 协同酶切将RRhP I 转化为人胰岛素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo löL ZnCl2 终止反应并沉淀h I。
2. 4 h I 的纯化
将h I 粗品用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上进行分离纯化。层析柱的平衡液和洗脱液均为0. 2 mo löL 乙酸钠2乙酸, pH4. 0。
2. 5 HPLC 分析
在HPLC 仪上, 用ODS C18 反相柱(150mm ×6. 0mm ) 进行分析, 流动相为0. 2mo löL(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo löL H3PO 4 调pH 至3. 5) 和50%乙腈水溶液按1∶1 (vöv ) 混合而成, 流速1. 0m löm in, 检测波长214 nm , 上样量20 u l。
2. 10 氨基酸组成分析
称样品2. 5 m g, 加6 mo löL HCl 2 m l, 110℃水解24 h, 蒸干后加入2 m l 无离子水溶解, 直接进样,在氨基酸分析仪上进行氨基酸组成分析。
2. 11 h I 整体生物活性的鉴定
按2000 版《中华人民共和国药典》的规定用小白鼠惊厥法鉴定h I 的整体活性。
3 结 果
3. 1 RRhP I 的初步纯化
层析图谱见图1, RRhP I 主要集中在峰2。收集峰2, 进行SDS2PA GE 分析, 见图2。结果显示电泳条带主要集中在13 KD 附近, 峰1 为穿透峰, 此峰中含有p I 高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白质, 而绝大部分p I 低于RRhP I 的蛋白质和核酸类杂质牢固地结合在柱子上, 需要较高的盐浓度才能洗脱下来。
表1 是6 次层析的重复实验结果, 可以看出,RRhP I 的回收率较高, 稳定在75%～ 80% 左右。
表1 离子交换层析的RRhP I 回收率
Table 1 RRhP I recovery of DEAE-Sepharrose Fast Flow ionexchange chromatography
Test number (n= 6) RRhP I recovery (% )
1 75. 2
2 77. 0
3 75. 5
4 78. 2
5 79. 6
6 79. 8
x±s 77. 55±1. 81
3. 2 复性及重折叠
经过初步纯化的RRhP I 通过Sephadex G225柱层析脱尿素并转换缓冲液为50 mmo löL 甘氨酸2N aOH, pH9. 5。层析图谱(见图3) , 有2 个层析峰,峰2 主要为折叠趋于正确的单体RRhP I, 收集峰2。进行SDS2PA GE 分析。结果(见图2) 显示, 收集的RRhP I 样品中高分子量杂蛋白的含量有所减少。峰1 为高分子量杂蛋白和RRhP I 的二聚体或多聚体及折叠不完全或不正确的RRhP I。
3. 3 RRhP I 酶切转化h I
在收集的RRhP I 单体组分中, 加入2. 5 mmo löL 还原型谷胱甘肽和0. 25 mmo löL 氧化型谷胱甘肽以控制2SH 比例, 通过二硫键的交换形成稳定的具有天然结构的RRhP I。在37℃条件下, 用胰蛋白酶(1ö500, 酶öRRhP I 底物) 和羧肽酶B (1ö1000, 酶öRRhP I 底物) 协同酶切30～ 40 m in, (H is) 62A rg2A rg 和C 肽被准确切除, RRhP I 转化为h I。SDS2PA GE 结果表明, RRhP I 几乎被完全酶切转化为h I, 主要电泳条带的位置从13 KD 附近下移至与人胰岛素标准品平行的位置, 见图2。
3. 4 h I 的纯化
用0. 1 mo löL ZnCl2 沉淀的h I 粗产品可通过Superdex 75 进行纯层析图谱见图4, h I 主要集中在峰3。收集峰3 进行SDS2PA GE 分析, 结果显示, 见图2, 所得h I 组份在SDS2PA GE 分析中是均一的,只有一条蛋白带。将峰3 组分透析, 浓缩并冻干, 即可最终制得h I。
3. 5 产品的性质鉴定
3. 5. 1 SDS2PA GE 分析 结果(见图2) 表明, 本研究得到的产品的分子量与h I 标准品相同, 且纯度较高, 在SDS2PA GE 中呈一条蛋白带。3. 5. 2 HPLC 分析 本工艺制备的重组胰岛素制品主峰的保留时间(27. 757 m in) 与标准品h I 的保留时间(27. 968 m in) 基本一致, 而与猪胰岛素的保留时间(25. 437 m in) 有明显差别。
图4 Superdex 75 纯化hI
Fig 4 Gel f iltration of hI on Superdex 75Peak a and peak b: impurities, Peak c: h I
3. 5. 3 氨基酸组成分析 分析结果见表2, 该结果表明本工艺制备的重组胰岛素样品的氨基酸组成与h I 基本一致。样品中不含M et, 与胰岛素原一起表达的(H is) 62A rg2A rg 已被准确切除, 样品中只剩下1 个A rg 和2 个H is, 这表明RRhP I 已被成功地转化成了h I。
3. 5. 4 h I 整体生物活性的鉴定 5 只昆明种清洁级小白鼠(雄性20～ 24 g) , 按每20 g 体重皮下注射h I 样品1. 25 U , 注射后2 h 内均出现降血糖阳性反应, 其中有4 只惊厥。随即腹腔注射1m l 5% 葡萄糖注射液, 惊厥现象消失。这表明本工艺制备的h I 样品具有很好的降血糖活性。
4 讨 论
4. 1 RRhP I 的初步纯化
为了快速准确地从大量的杂蛋白中捕获目标产品, 特异性极高的亲和层析是一个理想的选择。通过专一性识别RRhP I 中的6 个组氨酸残基, N i2+ 2N TA 亲和层析可以一步纯化目标产物RRhP I[ 3 ]。但是,N i2+ 2N TA 亲和介质较昂贵, 势必增加生产成本, 所以在实际生产中很难推广应用, 只能用于表达筛选。为了降低成本, 本研究选用相对便宜的DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析初步纯化目标产物RRhP I。通过精心筛选层析条件, 目标产物的纯化效果较好, SDS2PA GE 分析结果显示, 电泳条带主要集中在MW 13 KD 左右, 收率达77. 5%±1. 81% (n= 6)。目前尚未见采用国产DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析纯化重组胰岛素产品的相关报道。
4. 2 复性及酶切转换
以包涵体形式表达的RRhP I 由于二硫键配对错误, 水溶性很差, 在进行DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析时, 为了增加RRhP I 的溶解度, 缓冲液中加入了大量的脲素, 此时RRhP I 处于变性环境中。因此, 在双酶切转化之前必须首先除去尿素, 使RRhP I 复性。本研究用Sephadex G225 层析去除变性剂, 可有效防止蛋白的聚集, 并诱导变性蛋白RRhP I 向其天然态折叠。在我们所采用的条件下进行层析, 得到2 个层析峰, 峰2 为折叠趋于正确的单体RRhP I。其中的高分之量杂蛋白有所减少。峰1为高分子量杂蛋白、多聚RRhP I 及折叠不完全或不正确的RRhP I。对这一部分进行再层析和折叠反应, 可以提高折叠的总收率。由此可见, 此步层析可达到纯化, 去除变性剂和诱导复性的三重效果。在体内, 参与胰岛素原转化过程的有两种Ca2+依赖的内肽酶以及羧肽酶H。在体外, 用胰蛋白酶和羧肽酶B 协同酶切同样可将胰岛素原转变成胰岛素[ 4, 5 ] , 这使得通过E. co li 表达人胰岛素原制备人胰岛素成为可能。在本研究构建的表达产物中, 引导肽(H is) 6 与胰岛素原之间插入了两个A rg, 这与C肽和胰岛素之间连接的方式是相同的, 因此在双酶切转化的同时, (H is) 62A rg2A rg 可以被准确去掉,不必另外采用其它的处理方式, 从而减化了后处理过程。在本研究所选用的酶切条件下, RRhP I 被准确有效地转变成了h I。SDS2PA GE 分析显示, 酶切较完全, 主要电泳条带从13 KD 附近转移到了与人胰岛素标准品平行的位置。
4. 3 胰岛素纯化
目前人们普遍使用制备型HPLC 进行基因工程产物的最后一步纯化[ 6～ 8 ]。这是因为HPLC 具有操作方便快捷, 分辨率高, 产品纯度能一次性达到临床要求等优点。但是HPLC 具有对软硬件的要求较高, 前期投入大, 纯化量有限等等缺点, 从而使生产能力受到影响。本研究在最后纯化制备人胰岛素时选用的Superdex 75 分子筛层析, 其具有机械强度高, 稳定性好, 重现性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨率高(13 000 p latesöm ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m löm in, 25℃) , 且可在低压下操作, pH 范围广(3～12) , 分离范围广(球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特异性吸附小, 负载量大, 层析条件易控制等等优点, 是一个非常理想的纯化基因工程产品的层析方法。用0.2 mo löL 乙酸钠2乙酸, pH4. 0 的缓冲液作平衡液和
洗脱液, 将h I 粗品经过Superdex 75 柱层析后, 我们得到了纯度较高的人胰岛素制品, SDS2PA GE 分析样品只有一条带。目前尚未见采用Superdex 75纯化基因工程产品的有关报道。胰岛素是天然生物活性物质, 必须保持天然的二级结构才能发挥降血糖的生物活性。小鼠惊厥实验的阳性结果充分表明, 本研究所选择的层析条件不但有效地纯化了表达产物, 而且有效地防止了目标产物h I 的失活变性, 本研究最终制备了纯度较高的具有天然活性的基因工程人胰岛素。
