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自由活动大鼠静脉通路的建立与维护

摘要: 　目的　建立可靠的自由活动大鼠长期静脉输液通路。方法　在前人的基础上,对自由活动大鼠静脉通路的建立进行了改进和有益的探索。

结果　70 %的实验大鼠能顺利完成为期一个月的非连续输液实验,手术死亡率、感染率和管理脱落率较低。结论　本文所建立的大鼠静脉输液通路实用可靠。

关键词:大鼠; 自由活动; 静脉输液通路　医学科研活动需要各种动物模型,很多模型需在动物身上建立一条长期输液的静脉通路,并且要求能在动物清醒、自由活动时输液或采血[1 ] 。最常用的动物为大鼠,也有猴、猪、兔和小鼠等[2～4 ] 。临床上体液支持、静脉营养支持、静脉血压监测、严重创伤、多脏器功能障碍、物质成瘾的动物实验均需建立静脉通路[3 ,5 ,6 ] 。本文在前人的基础上,介绍一种可靠的、相对经济的大鼠静脉通路建立和维护的技术。

1 　动物

　　清洁级雄性Sprague2Dawley (SD) 大鼠30 只,手术时3 月龄,体重250～300 g ,由中南大学湘雅二医院动物实验室提供。

2 　相关器材及术前准备

2.1 　插管以及输液转轴

管道包括静脉留置聚氨酯管( Polyurethane Intravascular Tubing) BPU-T30 , 内径0.58 mm ,外径0.91 mm。聚乙烯管BPE-T20 ,内径0.38 mm ,外径1.09 mm ,这种规格的聚乙烯管管壁较厚,可抵抗一定强度的外力撕扯。输液管(COEXTM Tubing , BCOEX-T22 ) , 内径0.61 mm , 外径1.60 mm。这种输液管内层为聚乙烯PE ,阻力小,液体通过流畅,化学性质稳定,不会与输液成分发生化学反应;外层为聚氯乙烯PVC ,抗撕扯性、耐久性好。整个输液系统的一个关键设备即输液转轴,既要能使液体通过,又要能使大鼠在笼中自由活动。输液转轴很好地解决了这一问题,它使液体通过的同时自身能做360 度旋转,阻力很小,加一个力臂,大鼠可轻松地在笼中活动。本实验所用的输液转轴型号为375/22 ,如图1 ,死腔(Dead volume) 为8μL ,摩擦力矩(Frictional torque) 为0.030 盎司2英寸oz-in (约2.160 g/cm) 。

两端可接输液管,右下部白色横杆为力臂,借助弹簧管与大鼠背部相连,注意两端为表面光滑的管道,没有螺纹,螺纹应为照片不清晰所致。

2.2 　固定和保护装置

要防止大鼠撕咬输液管道,必须要有保护和固定装置,输液转轴到大鼠背部的输液管道从一根25cm 长的弹簧管(电炉丝) 中间通过,弹簧管上端连输液转轴,下端连一个塑料件。大鼠输液在其两前肢上穿上一个由粘合布做成的马甲,马甲背部有一个塑料件,该塑料件可与弹簧管下端的塑料件对接,并有一个扣合装置。输液管从弹簧管内经塑料件到大鼠皮下再到颈外静脉,整个输液管无外露部分,故能有效防止大鼠撕咬。整个通路如图2 所示,但固定带(Harness) 由自制的马甲代替。

2.3 　术前准备

将BPU 管剪成4 cm 长小段,BPE 管剪成10 cm长,BPU 管用三氯甲烷泡粗,一端套在BPE 管外面1cm ,组成13 cm 长管道。在连接部打一圈结,使之成“L”形,由于有一圈结,在“L”的拐角处有一个小圈。将做好的管子用75 %酒精浸泡消毒,并用生理盐水冲洗,手术前用生理盐水浸泡备用。1 mL 注射器针头作平头备用。准备眼科手术器材一套,硬膜外穿刺针一根,以便于在鼠背部与颈部打皮下隧道。

3 　手术过程

3.1 　分离静脉

大鼠手术时体重以250～280 g 为宜,用4 %戊巴比妥钠50 mgPkg 麻醉,同时给予阿托品013 mg/kg ,手术过程及术后注意保温。大鼠背部平肩胛处备皮,剪一小口,约1～2 mm 长,以备插管从背部穿出。翻转大鼠,头朝术者,颈部右侧备皮。从下颌至锁骨上缘纵形剪一小口,约2 cm 长,分离皮下组织,找到右侧颈外静脉(有的实验可选用股静脉[7 ] ) 并分离,滴适量生理盐水,防水干燥。

3.2 　插管

结扎静脉远心端,用眼科剪在静脉上剪一“V”形口,勿剪断静脉,先用一小段BPE-T10 管(内径0.28 mm ,外径0.60 mm) 插入静脉,因该管很细,插入较容易,再用BPE-T10 将“V”形口挑大一些,“L”形管远端连1 mL 注射器,注射器针头为平头,插管前端剪成斜面,管内注满生理盐水。用镊子夹住BPU-T30 插入“V”形口,插入静脉3.5～4.0 cm。

3.3 　固定插管

在静脉上打结固定插管,因为血管内的插管有1 cm 的BPU 管是套在BPE 管外面,而BPE-T20 管壁较厚,故在此段血管上打结可稍用力,使固定牢固,而不用担心管腔会被扎闭。用手术缝针在插管小圈内连线,将其缝在血管旁边的肌肉上,线圈要稍宽松,以防肌肉坏死。

314 　打隧道及缝合、穿马甲

用硬膜外穿刺针从颈部切口到背部小口打皮下隧道,取下1 mL 注射器,插管从隧道穿出大鼠背部,再次连上1 mL 注射器,倒抽回血确认插管在血管内,缝合颈部切口。从插管中打入20 万u 青霉素,用堵头套在插管末端,给大鼠穿上马甲;由于麻醉时大鼠身体较软,马甲不可穿是过紧,以防大鼠窒息。将大鼠放入单养笼,保温至其苏醒。

4 　术后维护及输液

　　手术后大鼠休养3 d ,每日从静脉插管注入20万u 青霉素,随后可每日给予10 万u。给药同时即可起到通畅管道作用。肝毒可不作为常规用药,如发现通道压力增加时可临时给予肝素200～500 u。实验时将大鼠放入输液笼。自身给药实验采用行为操作笼及相应的行为软件控制。将输液管与注射泵相连,大鼠背部的PE 管与弹簧管内的输液管对接,输液完成后可将大鼠从输液笼中取出,BPE 管末端套上塑料堵头,放入饲养笼中单养。输液时大体如图3 所示。

因本输液系统大鼠不输液时回到饲养笼,故每次连接管道时要排尽管管道中的空气,避免空气栓塞,并注意无菌操作。

5 　结果

　　30 只大鼠手术麻醉时死亡1 只,术后次日死亡2 只,余下27 只中途5 只发生管道堵塞,无一例感染发生,共有22 只完成为期1 个月的自身给药实验。

6 　讨论

　　发达国家在实验研究中给小动物输液有40～50 年的历史[8 ] ,自从输液转轴由Michael Loughnane(随后他将其商业化并成立了INSTECH SOLOMON公司) 于上个世纪60 年代发明之后,众多的商业公司相继开发了许多给动物输液的配套产品,例如适于各种动物的规格繁多的导管、输液转轴、固定装置、注射泵、笼子、软件等。国内在这方面也有近20 年的历史,少数科研单位对此技术进行了有益的探索,并设计了一些价廉实用的装置[6 ,9～11 ] 。

在实验中给动物输液有几个环节比较关键,一是输液管道和输液转轴,二是插管的固定和连接方法,三是输液时对管道的保护及减少大鼠自由活动的障碍,四是术后的维护。从这几个方面看,国内报道的系统有一些问题。比如从注射泵到大鼠静脉的输液管道全部采用硅胶管[12 ] ,口径也不尽相同,有外径019 mm、112 mm 等。硅胶管能有效减轻排斥反应,但材质柔软,如全程采用硅胶管,一是插入静脉后结扎时不能扎紧,否则有扎闭管道的危险[12 ] ,从而管道易脱落;二是管道在输液时尽管外面有弹簧管保护,仍有被拉伸扩张的可能,造成给药量不准,这一点对于自身给药实验尤其重要,因为自身给药实验为非连续输液,每一次给药剂量较小,要求系统能准确及时地将微量药物泵入动物体内;三是全程采用硅胶管者一般管道不会中断,大鼠手术完成后即24 h 呆在输液笼内,直至整个实验结束。这样大鼠背带弹簧管,容易抑制其自主活动;如果实验中间更换药物也极不方便;管道意外破损也难以补救;不给药时亦不能进行其它实验,例如行为实验条件性位置偏爱等[3 ] 。本实验大鼠体内管道采用BPU 管与BPE 管连接,BPU 排斥反应与硅胶管相似,BPE 管坚固,从而有效解决了上述问题。输液转轴,这一输液系统中最有技术含量的环节,国内企业尚无类似产品出售。许多文献报道的输液系统均采用自行设计的类似装置,比如用活动套管和轴承做成注射器样的结构,或头皮针在橡胶中转动来实现输液时360 度旋转等[9 ,13 ,14 ] 。这些设计难免会出现漏液、阻力大、死腔大等缺陷,长期实验困难较大。插管在大鼠体内的固定与插管的关系前已述及,插管从大鼠背部穿出后,用马甲固定,插管与大鼠背部垂直,能避免大鼠撕咬。马甲与弹簧管利用塑料件可方便地实现对接与分离。有的系统将弹簧管末端扩成螺圈,将螺圈缝在大鼠背部[10 ,15 ] ,这样大鼠容易感染,活动时也有疼痛感。弹簧管的长度与笼子的大小要匹配,以避免弹簧过松或过紧。笼子的空间也不能过大或过小,本实验操作笼大小为30 cm ×30 cm ×30 cm。输液时装输液转轴的吊杆可利用杠杆原理,在支点后装一合适的负荷,因大鼠的力臂长,能有效减轻或抵消大鼠活动时背部的负载。注意虽然输液转轴可以360度旋转,大鼠仍然只能实现相对的自由活动,翻滚旋转运动则受到限制。大鼠静脉长期给药是一项复杂的实验技术,不仅手术有一定难度,整个输液设备均有特殊要求,每个细微的环节都可能影响整个实验的结果,本文所报道的方法有一个明显的缺点,就是大量使用国外的相关产品,购买不方便,但却是目前保证实验顺利进行的明智选择。也只有使用规范的实验装置,才能得到准确可靠的实验结果,易于被其它的实验室验证,从而获得同行的公认。