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PEI转染法

1. 接种细胞：用胶原酶消化细胞并计数（不建议用胰酶）。转染前18-24小时进行细胞的铺板，以便在转染时，贴壁细胞的密度大约在80%左右。注：培养液中的血清和抗生素不影响转染效率。

    2.   准备 EZ Trans-DNA 复合物

        （1）转染前将所有试剂置于室温10分钟。下面，以转染24孔板培养皿为例，说明转染的具体方法（如果在别的培养器皿中进行转染，各试剂建议使用量见表1.：

       （2）将1 μg 质粒DNA稀释到40 μL无血清的高糖DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次。

       （3）将3 μL EZ Trans转染试剂稀释到40 μL无血清的高糖DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次。

      注：无血清的高糖DMEM培养基是稀释液，不能使用含血清的培养基（包括Opti-MEM）进行DNA和EZ Trans转染试剂的稀释！因为EZ Trans-DNA转染复合物的形成过程不能含有血清。

       （4）将稀释好的EZ Trans转染试剂一次性全部加入到已稀释好的质粒DNA中，立即用移液枪吹吸3-4次。

     注：此混合的顺序不能反向进行！

      （5）室温放置10-15分钟，以形成EZ Trans-DNA复合物。

表1：不同培养体积对应的待转DNA、EZ Trans、稀释液用量

3.   转染细胞

1. 将上述80 μL EZ Trans-DNA转染复合物均匀滴入到含细胞的培养皿中。轻轻晃动培养皿或轻微涡旋，让EZ Trans-DNA复合物分散均匀。

2. 在 CO₂培养箱中 37℃下孵育细胞，转染后12-18小时，去除含EZ Trans-DNA复合物的培养液。（若细胞形态欠佳，可在转染3-5h后，添加1/2体积的包含30%血清的生长培养基，在转染12-18小时后完全去除含EZ Trans-DNA复合物的培养液，用含血清和抗生素的新鲜培养液。）

3. 转染后最快7h即可检测到转入基因的表达，可根据需要在24-48小时内检测转染效率。

      注：筛选稳定转染细胞株，可在上述操作后（转染细胞24小时后），将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释10倍以上），在 CO₂培养箱中 37℃孵育过夜。在有转染抗性基因相匹配的药物筛选条件下，约 1～2周可筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。

运输与保存方法

       常温运输，4℃保存，保质期12个月。

使用注意事项

       质粒质量：请务必使用高质量转染级无内毒素质粒。通过260 nm光吸收测定DNA 浓度，260nm / 280nm比值确定 DNA 纯度（比值应该在1.8～2.0的范围之内）。如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

      细胞条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者李记生物的胎牛血清培养细胞。

特别提醒

1. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞，在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板，可适当降低铺板密度，以确保转染时细胞的汇合度仍为70～80%。

2. 对于接触抑制敏感的细胞，可适当降低铺板密度。

3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情况下，DNA-PEI复合物仍能转染细胞，但是DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。

4. 对大多数细胞来而言，每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每 1 μg DNA使用 1～4μL体积线性PEI转染试剂进行优化。

EZ Trans转染液用于不同细胞转染时用量参考（以96孔板为例）