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FluorCam多光谱荧光成像技术应用案例——植物病害表型研究

1. 植物病害早期快速无损检测

由于次生代谢产物如多酚等与植物的病害胁迫应答机制紧密相关。因此最初，FluorCam多光谱荧光成像技术主要用于植物病害早期快速无损检测，希望能在病害产生严重影响前就能发现感染（图1）。                 

图1. UV-MCF多光谱荧光成像早期研究，左：烟草花叶病毒感染的多光谱荧光连续观测（Chaerle，2006）；右：辣椒轻斑驳病毒感染早期的多光谱荧光分析（Pineda，2008）

随着研究的不断深入，科学家们将多光谱荧光成像与叶绿素荧光成像、红外热成像、以NDVI归一化植被指数为代表的反射光谱成像等其他表型分析技术结合，开展了更深入的植物病害检测和表型研究工作。

德国莱布尼茨蔬菜和观赏植物研究所IGZ致力于通过这些成像分析技术发展一种能够高通量快速检测生物胁迫的方法。他们使用了一种模式植物-病原体系统生菜-立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），希望通过这几种技术获得的数据能够快速将受到生物胁迫和未受到胁迫的植株区分开（Sandmann，2017）。

图2. 生菜-立枯丝核菌的NDVI成像图与热成像图

由于这几种技术的原理不尽相同，类似的研究中经常需要使用多种仪器才能完成。而FluorCam多光谱荧光成像系统是目前唯一有能力实现了一台仪器上同时完成叶绿素荧光、多光谱荧光、NDVI归一化植被指数以及GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等荧光蛋白与荧光染料的成像分析功能，加装热成像模块后还可以进行热成像分析。这些功能使得FluorCam多光谱荧光成像系统就成为了一套功能非常全面的植物病害表型研究系统。

通过数据分析最终发现叶绿素荧光参数：PSII最大量子产额Fv/Fm和荧光衰减比率Rfd的区分效果最好，误差≤0.052。研究者希望通过进一步工作，将这一发现应用于园艺和农业生产实践。

图3. FluorCam多光谱荧光成像系统测量的各项表型参数及分析数据结果

2. 叶片病害

细菌性软腐病菌Dickeya dadantii是农业上的重要病害。这种病菌会先围绕一个萎黄环出现多个坏死斑点，进而整个感染区域坏死并逐渐扩展到周围的组织中。FluorCam叶绿素荧光成像、FluorCam多光谱荧光成像、热成像可以在时间和空间尺度上分别反映细菌感染对光合作用、初级和次级代谢和气孔活性的影响。西班牙国家研究委员会（CSIC）使用这三种技术对甜瓜叶感染Dickeya dadantii进行了成像测量，同时通过机器学习来处理这些成像技术获得的数据，建立数学算法来分类叶片感染区域（Pineda, 2018）。

图4. 甜瓜叶感染Dickeya dadantii不同时期的叶绿素荧光成像、多光谱荧光成像和热成像图

根据成像图获得的叶绿素荧光和多光谱荧光定量数据

除病毒和细菌外，真菌引起的植物叶片病害也有广泛的研究，比如由真菌Podosphaera fusc感染引起的白粉病。通过对感染白粉病的西葫芦叶片进行FluorCam多光谱荧光和热成像分析，发现多光谱荧光参数F520/F680对于识别白粉病特别灵敏。这也证明了多光谱荧光非常适用于类似的植物表型研究（Pineda, 2017）。

图5. 感染白粉病的西葫芦叶片：（a）RGB成像；（b）热成像；（c）多光谱荧光F440成像；（d）多光谱荧光F520/F680成像

3. 根系病害

由于根系难以直接观察和检测，因此根系病害具有一定的隐蔽性。往往在发现病害时，其症状已经发展到中后期。鳄梨根系感染白纹羽病Rosellinia necatrix后，通过叶片的叶绿素荧光成像、多光谱荧光成像、热成像分析，发现病害造成的根系功能损失，能够同步影响叶片的光合生理、次生代谢和气孔功能。而叶绿素荧光参数甚至可以在症状发展前就指示出病害的发生。通过FluorCam多光谱荧光成像技术进行的这一研究既发现了根系病害对植物整体生理功能和地上部表型的影响，也为根系病害提供了早期检测工具（Granum, 2015）。

图6. 感染白纹羽病的鳄梨：左：地上部RGB图；右：叶绿素荧光、多光谱荧光与热成像图

4. 种子病害

间座壳属Diaporthe/拟茎点霉属Phomopsis病原菌复合体是一类大豆种传性病原体。它会首先感染大豆种子并以休眠菌丝的形态存活。而随着大豆的萌发和生长，它就会造成大豆种腐病等严重病害。

阿根廷布宜诺斯艾利斯大学尝试使用不同的非热等离子体Non-thermal plasma处理间座壳属Diaporthe/拟茎点霉属Phomopsis病原菌复合体侵染的大豆种子，然后对种子萌发和营养生长状况进行评估，从而确定这种种子病害消毒方法是否理想——既能控制病害，又不会对大豆的营养生长造成不利影响。FluorCam叶绿素荧光、FluorCam多光谱荧光成像、热成像等都为这一研究提供的重要的数据。实验结果发现，非热等离子体处理后的感染大豆，其光合能力与健康植株基本相同。而比起未进行处理的大豆，其生长状况甚至有所提高（Pérez-Pizá, 2019）。

图7. 左：不同感染状况和处理后的大豆幼苗；右：大豆的RGB成像、热成像、多光谱荧光成像

参考文献：

1. Chaerle L, et al. 2006, Multi-color fluorescence imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus, Journal of Plant Physiology, doi:10.1016/j.jplph.2006.01.011

2. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060

3. Sandmann M, et al. 2017. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease, doi: 10.1094/PDIS-10-17-1536-RE

4. Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164

5. Pérez-Pizá MC, et al. 2019. Improvement of growth and yield of soybean plants through the application of non-thermal plasmas to seeds with different health status. Heliyon 5: e01495

6. Granum E, et al. 2015. Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9

7. Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology, https://doi.org/10.1071/FP16164