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 有关原核表达的引物设计

1)对表达载体的分析

A．载体的选择

选择载体通常关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 
B．翻译的起始位点

要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。 
C．在起始密码子附近的mRNA二级结构

外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起 始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。

2） 对目的片段的分析

A. 基因（或蛋白）的大小

原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使 用较小的标签（如6×组氨酸标签）。

B.表达序列的GC含量

表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNA STAR、VectorNTI Suite等软件进行预测。 
C亲疏水性

亲水区域时表达量会比较高，疏水性区域会增加实验难度。利用软件对氨基酸的亲疏水性进行分析，确定需要表达的区域。

3) 具体引物设计

A. 参照引物设计“总的原则”。

B.查表达外源片段中含有什么内切酶位点，避免设计重了，酶切后电泳就会老发现有预期外的小片段出现。另外，同等情况下，要选择酶切效率高的酶。在设计酶切位点的5’端要加保护碱基，使限制性内切酶能有效识别，不同内切酶所需的保护碱基不同，可参考网上的统计表。

C. 要特别注意起始密码子和终止密码子的读码框，不要造成目的片段碱基移码。如果载体上有起始密码子ATG，可不另加，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，中间还含有载体序列，这种情况一定要保证中间这段序列不会造成外源序列的移码。同理，正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。大部分载体也有终止密码子，如果对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子。

D. 把上游引物设计成有义链，下游设计成反义链，否则没有片段出现。

E. 引物设计中引物的酶切位点、保护性碱基等不会与模板匹配，所以考虑引物Tm值时这些碱基不在计算之列。

F.对密码子的使用频率进行分析。如果在大肠杆菌中使用较少的密码子在外源片段中连续出现，尽量避开。大肠杆菌稀有密码子预测网址：http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html、

http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm、

http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/、http://www.doe-mbi.ucla.edu/~sumchan/caltor.html

稀有密码子优化软件：http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/、http://baderlab.bme.jhu.edu/gd/、https://www.dna20.com/index.php?pageID=316 以及Synthetic gene design 软件。