来宝网 2022/12/20点击409次
骨质疏松症是一种全身性代谢性骨病，其特征是骨髓间隙中的骨形成减少，导致骨量丢失和微观结构退变。据估计，骨质疏松症每年导致全球超过900万例骨折。因此，迫切需要替代骨质疏松症的治疗方法，特别是能够抵消骨量流失的疗法，这对于老年人群至关重要。
人骨髓来源的间充质干细胞（hMSCs）由于其多能性，是骨组织工程和再生医学的细胞疗法的理想选择。在机械或化学刺激下，可以诱导hMSCs分化为各种谱系，包括成骨细胞、神经母细胞、成脂肪细胞、成肌细胞和成软骨细胞。此外，hMSCs的分化受到局部机械和化学环境的密切控制，从而在成骨分化和脂肪分化之间保持平衡。成骨分化减少和脂肪分化增加可能导致骨质疏松症。研究已经鉴定出许多化学刺激（例如，小的生物活性分子，生长因子和遗传调节因子）来调节hMSCs谱系，包括骨形态发生蛋白（BMP），Wnt和Notch信号。
成骨分化是一个动态过程，涉及几种重要的信号通路，包括YAP / TAZ（具有PDZ结合基序的转录共激活因子），Notch和RhoA信号通路。研究表明，流体剪切力调节间充质干细胞（MSCs）的体外成骨分化。尽管目前的研究表明剪切应力可以增强成骨分化，但由于缺乏有效的工具来检测和监测活细胞中的基因表达，Notch信号在剪切应力诱导的成骨中的参与尚不清楚。
在美国纽黑文大学生物医学工程系、利哈伊大学生物工程系、杜克大学生物医学工程系、康涅狄格大学生物医学工程系的一项联合研究中，利用双链锁核酸/DNA（LNA/DNA）纳米生物传感器阐明了Notch信号在暴露于生理相关剪切应力（3-7 dynes/cm2）的hMSCs的成骨分化过程中的调节作用，研究结果将为剪切应力下hMSCs的成骨分化和Notch信号的参与提供新的信息。
流体剪切应力调节人骨髓来源的间充质干细胞的增殖和活力
为了研究不同水平的剪切应力对细胞增殖和活力的影响，设计并比较了3组实验：静态组，6 h剪切力刺激组和不间断剪切力刺激组。实验研究了两种不同水平的剪切应力：低流体剪切应力（1–9 dynes/cm2）和高流体剪切应力（9–20 dynes/cm2），分别在第3天和5天后评估细胞活力和增殖。
图1 A显示了不同组别下hMSCs在剪切应力下5 d后的荧光图像。当hMSCs暴露于连续剪切力5天时，死细胞的数量增加。实验进一步量化了剪切应力对细胞活力和增殖的影响。施用剪切3 d后，剪切应力下hMSCs的细胞活力和增殖与静态条件下的hMSCs相比没有显著差异（图1 B、C 左）。5 天后，连续剪切应力下的 hMSCs 细胞活力和增殖显著降低，与静态条件下的细胞相比，细胞活力降低 21.5%，增殖减少19.8%（图1 B、C 右）。此外，在每天6 h施加剪切应力5天后，hMSCs的细胞活力和增殖与静态状态的hMSCs相比没有显著差异。
此外，还研究了高流体剪切应力（9-20 dynes/cm2）对hMSCs的活力和增殖的影响。暴露于高剪切应力3天的hMSCs，不间断剪切应力组的细胞活力降低了55%。5 d后，6 h刺激组和不间断刺激组的死细胞数量均显著增加。此外，与静态的hMSCs相比，细胞活力分别降低了14.8%和19.2%。高流体剪切应力对细胞增殖的影响具有类似的影响。
这些结果表明，剪切应力调节细胞增殖和活力与时间和速度有关。在高流体剪切应力下，细胞活力和增殖降低。在低流体剪切应力下，当细胞暴露于周期性剪切（6h 剪切/天）而不是连续剪切（不间断剪切）时，其活力和增殖不受影响。总之，对于低流体剪切应力下的hMSCs，每天6小时，持续5天，与静态条件相比，细胞活力和增殖没有显著差异。因此，接下来的实验选择了3-7 dynes/cm2，以避免剪切应力对其余研究的细胞活力和增殖的影响。
图1 剪切应力对细胞活力和增殖的影响。
低流体剪切应力调节人骨髓来源的间充质干细胞的形态
为了研究低流体剪切应力对hMSCs形态的影响，实验量化并比较了细胞表型行为，包括在有（3-7 dyne/cm2，6h）和没有剪切应力下的细胞面积，细胞长度，细胞长宽比以及细胞周长。
图2 A、B显示了hMSCs在静态条件下（图2 A）和暴露于剪切应力下（图2 B）的荧光图像。3天后，与静态条件下培养的hMSCs相比，在剪切应力下培养的hMSCs的细胞面积、长宽比、周长和细胞长度略有增加（细胞面积增加16.3%，细胞长宽比增加14.9%，周长增加18%，细胞长度增加12%）。然而，与在静态条件下培养的hMSCs相比，暴露于低流体剪切应力5天的hMSCs分别显示出细胞面积增加55%，细胞长度增加72%，细胞长宽比增加16%和细胞周长增加30%（图2 C、D）。这些结果表明，hMSCs对低流体剪切应力敏感，形态变化显著。
图2 剪切应力对hMSCs形态变化的影响。
低流体剪切应力促进成骨分化
通过施加剪切力（3-7 dyne/cm2），进一步阐明了低流体剪切应力对成骨分化的影响，在成骨诱导和剪切刺激5天后，通过测量ALP酶活性来评估和比较成骨分化，ALP酶活性是早期成骨分化的可靠生化标志物。
图3 A、B分别显示了静态和剪切应力下hMSCs的荧光图像。在剪切应力下，当诱导hMSCs进行成骨分化时，肌动蛋白细胞骨架发生显著改变。结果表明，在没有成骨诱导的情况下，绿色荧光信号最小，表明ALP酶活性最小。随着成骨诱导，在静态和剪切应力下，hMSCs的ALP酶活性显著提高。在静态条件下，在成骨诱导培养基中培养的hMSCs的ALP活性比在基础培养基中培养的hMSCs提高了1.8倍。在低流体剪切应力下，ALP活性提高了2.1倍。此外，与静态条件相比，暴露于剪切应力的hMSCs在成骨诱导后ALP活性增加了15%（图3 C）。此外，在低流体剪切应力下，hMSCs分化率提高到45.51%，而静态条件下hMSCs分化率为38.02%（图3 D）。这些结果表明，低流体剪切应力显著增强了成骨分化，ALP酶活性和成骨分化率增加。
图3 剪切应力增强hMSCs成骨分化。
Notch信号参与剪切应力诱导的成骨分化
先前的研究表明，Notch信号参与hMSCs成骨分化过程，介导的ALP活性以及成骨分化率。然而，低流体剪切应力是否通过Notch信号调节hMSCs的成骨分化尚不清楚。为了更好地了解Notch信号在成骨分化过程中的参与，利用药物DAPT（Notch信号抑制剂）来扰乱Notch信号传导。hMSCs在有或没有剪切应力下的成骨分化过程中用浓度为20 μM的DAPT处理，以观察潜在的相关影响。
图4 A、B显示了hMSCs在静态条件和剪切应力下在基础培养基，诱导培养基和加DAPT处理的诱导培养基中培养的代表性图像。结果表明，使用DAPT抑制Notch信号在静态条件和剪切应力下介导了成骨分化。特别是在静态条件下，随着DAPT的处理，成骨诱导5 d后的ALP酶活性降低了28.8%。同时，暴露于低流体剪切应力的hMSCs，诱导5 d后的ALP酶活性在DAPT处理下降低了18.2%。有趣的是，剪切应力下hMSCs的DAPT处理对成骨分化的影响较小，表明低流体剪切应力挽救了药物处理引起的Notch信号传导的抑制作用。
为了进一步研究在低流体剪切应力下成骨分化过程中Notch信号传导的机制，实验利用LNA/DNA纳米生物传感器在基础培养基，诱导培养基和DAPT处理的诱导培养基中检查了静态和剪切力条件下的Notch 1配体，Dll4 mRNA的表达。图4 A、B显示了不同处理下静态和剪应力下hMSCs的代表性图像。在静态条件下，用成骨诱导培养基培养的hMSCs显示出Dll4 mRNA的表达显著增加。DAPT处理后，与成骨诱导组相比，Dll4 mRNA显著降低（图4 D）。当暴露于低流体剪切应力时，成骨诱导组hMSCs的Dll4 mRNA表达比在基础培养基中培养的hMSCs增加了2.72倍。DAPT的处理抑制成骨分化约50%（图4 D）。与静态相比，在成骨诱导培养基中培养hMSCs时，Dll4 mRNA表达提高了22.8%。DAPT处理介导剪切应力对成骨分化的影响，Dll4 mRNA表达仅增加约16%。
这些结果证明，Notch信号参与并调节了低流体剪切应力下hMSCs的成骨分化。低流体剪切应力上调成骨诱导下hMSCs的Dll4 mRNA表达，表明Notch信号参与机械调节的成骨分化。Notch信号的抑制介导了剪切应力诱导的成骨分化的影响，ALP酶活性降低，Dll4 mRNA表达降低。
图4 Notch信号在有和无剪切应力情况下调节hMSCs的成骨分化。
在这项研究中，利用LNA/DNA纳米生物传感器在暴露于生理相关的低流体剪切应力的hMSCs的成骨分化过程中检测Dll4 mRNA基因表达谱。研究结果证明，Notch信号调节剪切应力诱导的成骨分化，表明Notch信号在成骨分化中的机械敏感性作用。进一步的研究可能阐明Notch信号在调节干细胞分化中的机械敏感作用的机制。
参考文献：Zhao Y, Richardson K, Yang R, Bousraou Z, Lee YK, Fasciano S, Wang S. Notch signaling and fluid shear stress in regulating osteogenic differentiation. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Oct 5;10:1007430. doi: 10.3389/fbioe.2022.1007430. PMID: 36277376; PMCID: PMC9581166.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36277376/
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