来宝网 2014/1/7点击1672次
程晓明,王长征,李淑平,钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆 400037)
提 要 : 目的 建立一种可靠的哮喘致敏小鼠模型及分离脾脏 CD4+T细胞。方法 采用卵蛋白致敏的方法建立模型 ,运用panning法分离 CD4+T细胞。结果 此模型小鼠肺组织呈现典型的哮喘样病理改变 ,其外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)显著高于正常对照组( P < 0.01) 。CD4+T细胞纯度经流式细胞术(FCM)检测 ,纯度达 97.3 %。结论 此方法建立的模型及分离的 CD4+T细胞可用于哮喘的实验研究。
建立哮喘动物模型及分离高纯度的 CD4+T细胞是实验研究哮喘发病机制的重要前提。本实验就小鼠致敏模型的建立及其脾脏 CD4+T细胞的分离方法进行介绍。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料
1.1.1 淋巴细胞分离液 将 9 % ficoll 400 溶液(Sigma 公司)和 33.9 %泛影葡胺溶液按比例混合 ,调比重至 1.090。
1.1.2 尼龙毛柱的制备 称取 80mg 尼龙毛 ,将其细致撕匀后装入 2 ml 一次性注射器内 ,柱高约 4 cm。用 Hanks 液充分浸湿尼龙毛柱 ,使其内不留气泡 ,高压灭菌消毒。使用前用预温至 37 ℃的 RPMI 1640(含 10 %胎牛血清 ,Fetal calf serum ,FCS)洗柱后封闭下端出口。
1.1.3 CD8+单克隆抗体(Monoclonal antibody ,mAb)包被平皿的制备 取若干个聚苯乙烯平皿 ,将 CD8+mAb 溶液(北京邦定公司)100μl 加入平皿中 ,并加入 0. 05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH9.5)3 ml ,混匀 ,室温下无菌放置 40 min ,磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.2)漂洗 ,加入含 1 % FCS的 PBS,室温下无菌孵育 15 min ,PBS漂洗 ,4 ℃保存备用。
1.2 实验动物及分组
4～6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,体重 16～20 g ,由第三军医大学实验动物中心提供。将小鼠随机分为两组 ,A组为正常对照组 ,以生理盐水代替鸡卵清蛋白 (Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激发小鼠 ;B 组为致敏模型组 ,给予 OVA致敏和激发。
1.3 致敏小鼠模型的建立
分别于第 1 天、第 13 天经小鼠腹腔注射 OVA 10μg 和氢氧化铝凝胶(Al(OH)3)20 mg混合液;第 25 天时 ,将每只小鼠单独置于 5 L 密闭容器中 ,以 1 % OVA 进行雾化吸入激发 ,使小鼠暴露在 OVA 气雾中 20～30 min 直至出现哮喘样发作为止 ,持续 6 d。由 402 型超声雾化器(上海合力医用器械厂)提供雾化动力。
1.4 外周血、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage
fluid ,BALF)中嗜酸性粒细胞百分比 (percentages
of eosinophils ,EOS %)计数及肺组织标本留取
1.4.1 外周血及 BALF中 EOS%计数 各组小鼠各 14 只最
后一次激发 24 h 后 ,经腹腔麻醉 ,行气管切开 ,收集 BALF 5ml ,
针刺心脏取血约 0. 5～0. 8 ml。将全部液体离心 ,收集沉淀细
胞 ,加入红细胞裂解液去除红细胞。用 EOS 计数液行 EOS 计
数。
1.4.2 肺组织标本留取 打开未经支气管肺泡灌洗的各组各 6 只小鼠胸腔 ,观察肺脏的大体改变 ,剪取部分肺组织 ,经10 %甲醛固定后切片 ,行 HE染色。
1.5 CD4+T细胞的分离及鉴定
1.5.1 CD4+T细胞的分离 打开小鼠腹腔 ,无菌取出脾脏放入冷 Hanks液中 ,将其捻碎并滤过 100 目无菌钢网 ,收集脾细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中 ,2 000 g 离心 30 min ,沿管壁轻轻吸出中间灰白色细胞层 ,重悬于含 10 % FCS的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 ×108个细胞加入尼龙毛柱中 ,37 ℃,5 %CO2孵箱中孵育 1 h;打开下端出口 ,使 T细胞悬液以 40～60 滴(Drop ,d)/ min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反复洗柱至洗脱液达 6～8 ml ,将细胞悬液按每 1 ×107个加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混匀 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分钟轻轻旋摇 1 次 ,沿平皿壁吸取细胞悬液并用 RPMI 1640 溶液轻洗 2 次 ,2 000 g离心 10 min ,收集的细胞悬液即 CD4+T细胞。经台盼蓝计数 ,细胞存活率 > 89 %。
1.5.2 CD4+T细胞纯度鉴定 采用流式细胞术(Flow cytom2etry ,FCM)鉴定 CD4+T细胞纯度[1]。
1.6 统计学分析 各组结果以 ?x ±s 表示 ,各组间比较采用非配对 t 检验。
2 结果
2.1 小鼠致敏模型的肺组织病理改变 致敏组小鼠的肺脏与正常对照组小鼠的肺脏相比体积明显增大 ,表面肿胀 ,有多处形状不规则的暗红色充血区。切面有白色泡沫状渗出物 ,并可见明显的血管断面。肺组织切片HE 染色可见支气管及血管周围有大量的炎性细胞浸润 ,以EOS为主 ,肺间质及肺泡腔内也可见 EOS浸润。细小的支气管内可见粘液栓。气道上皮多处断裂 ,基底膜明显增厚且形态不规则。细支气管平滑肌发生肥厚性增生。
2.2 外周血及 BALF中 EOS %
2.2.1 外周血 EOS% 致敏组小鼠外周血 EOS%(11. 0 ±2.7)与正常对照组(0.7 ±0.5)比较显著增高( P < 0.01) 。
2.2.2 BALF中 EOS% 正常对照组小鼠 BALF 中几乎没有EOS(0.0 ±0.01) ,致敏组小鼠 BALF 中 EOS%(21. 9 ±4. 4) 与正常对照组比较显著升高( P < 0.01) 。
2.3 CD4+T细胞纯度鉴定结果
经 FCM检测 ,CD4+T细胞的纯度为 97.3 % ,见图 1。
图 1 FCM检测 CD4+T细胞纯度
3 讨论
本实验建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表现为:肺脏明显水肿 ,细、小支气管内有多量的粘液栓 ,气道上皮断裂、脱落 ,基底膜增厚 ,支气管及肺血管周围有以 EOS为主的大量炎性细胞浸润 ,与哮喘的病理学特点相似 ;同时 ,此模型小鼠外周血及 BALF中 EOS %显著增加 ,与哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改变一致 ,说明此模型可用于哮喘的实验研究。
Panning 法又称洗淘法。它是运用抗原与抗体相结合的原理进行细胞分离的一种方法 ,具有简便 ,经济、细胞完整性好等特点。国外在 90 年代早、中期即将这种方法广泛用于实验中。随着科学技术的不断进步 ,目前国外用于分离细胞的方法主要是磁珠分离法[2]和流式细胞仪法[3],但其造价昂贵 ,在国内并不能
普遍开展 ,故运用 Panning 法分离细胞仍不失为一种高效、经济的方法。本实验用 Panning 法分离的 CD4+T细胞经 FCM检测 ,纯度高 ,完全可用于进一步的实验研究。
关键词 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T细胞
中图法分类号 : R - 332;R562.25 文献标识码 : B
参考文献 :
[1] 沈关心 ,周汝麟. 现代免疫学实验技术[M]. 武汉:湖北科学技术出版社 , 1998.180 - 183.
[2] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al. Antigen2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin24 production by CD4+Tcells[J ]. EurJ Immunol ,1997 ,27(10) :2 657 - 2 665.
[3] Denkers E Y, Scharton2Kersten T, Barbieri S, et al. A role for CD4+NK1.1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectorsfunction against in2tercellular infection[J ]. J Exp Med ,1996 , 184(1) : 131 - 139.
(编辑 陈聪连)
