来宝网 2019/4/18点击1167次
01 检测原理
胰蛋白酶活力的测定，可用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-α-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride）简称 BAEE作为底物。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，BAEE逐渐反应生成苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
即：
在波长253nm下BAEE的紫外光吸收远远弱于BA的紫外光吸收。随着反应进行，BA逐渐增多，反应体系的紫外吸收亦随之相应增加，以ΔA253 nm计算胰蛋白酶的活性。
由于血清中含有胰酶抑制成分，所以如果培养基中添加了血清，胰蛋白酶和BAEE的反应就会受阻，吸光度在一定范围内会减少；
而真正的无血清培养基中由于不含有胰酶抑制剂成分，所以无法抑制胰蛋白酶，所测吸光度应和阴性对照组一致。
02 检测体系
3mLBAEE溶液+ 40μL0.25%胰酶 + 200μL培养基样品
样品来源：
01 | 阴性对照——缓冲液 |
02 | 友康间充质干细胞无血清培养基 |
03 | DMEM/F12+10%FBS(excell) |
04 | DMEM/F12+10%FBS(ABW) |
05 | 某品牌无血清培养基 |
03 实验数据
检测结果如下
04 结果解读
不同检测体系 | 终反应OD值 |
阴性对照——缓冲液 | 0.069 |
yocon MSC无血清培养基 | 0.067 |
DMEM/F12+10%FBS(excell) | 0.028 |
DMEM/F12+10%FBS(ABW) | 0.023 |
某品牌MSC无血清培养基 | 0.026 |
阴性对照组： 无胰酶抑制剂，终反应OD值 0.069； 两个血清组： 血清对胰蛋白酶有抑制作用，终反应OD值分别是0.028和0.023； yocon MSC无血清培养基： 终反应OD值0.067，与阴性对照组一致，无法抑制胰蛋白酶活性，说明yocon MSC无血清培养基中不含血清； 而某品牌MSC无血清培养基： 终反应OD值0.026，与血清组吸光度一致，说明某品牌的MSC无血清培养基其中含有血清成分，并不是真正意义上的无血清培养基。 |
05 答疑
有的客户可能会说，是不是你们的间充质干细胞无血清培养基中就已经添加了胰酶抑制剂成分呢？
没有添加，也不能添加。原因有三：
1、由于胰酶抑制剂中的某些成分对鲎试剂检测内毒素有干扰，导致内毒素升高，所以如果向间充质干细胞无血清培养基中添加胰酶抑制剂成分会导致培养基内毒素升高——接近5EU/mL，而我们的培养基要求内毒素<0.25 EU/mL。
2、胰酶抑制剂并非间充质干细胞生长必需的物质，如果在培养基中添加的话反而会对细胞产生不良影响——细胞易衰老、易诱导分化。
3、不推荐使用胰酶进行细胞消化，因为胰酶对细胞的损伤极大，易出现过度消化的情况。
我们的培养程序中推荐使用干细胞专用的干细胞温和消化酶，细胞变圆后，直接添加消化酶5倍体积的PBS稀释即可。用不到胰酶抑制剂。
