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Southern Blot 实验指南

基本概念

   原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 
  用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

实验步骤

一、基因组DNA的制备

二、基因组DNA的限制酶切

根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入

DNA（1μg /μl）-------------------------------20 μg
10×酶切buffer --------------------------------4.0 μl
限制性内切酶（10U/μl）------------------5.0 μl
加ddH₂O 至----------------------500 μl

在最适温度下消化1-3Hour。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。若消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6 Hour已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解。

如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。

三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2.  电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。

四、转膜

转膜就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。

五、探针标记

进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。而探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。

例：

1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。

2. 在另一个0.5ml离心管中加入：

Labeling 5×buffer（含有随机引物）--------------------------10ul

dNTPmix  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)--------------2ul

BSA（小牛血清白蛋白）----------------------------------------2ul

[a-32P]dATP---------------------------------------------------------3ul

Klenow酶------------------------------------------------------------5U

3. 将变性模板DNA加入到上管中，加ddH₂O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。

4. 加50μl 终止缓冲液终止反应。

标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。

六、杂交

Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：

PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。

1. 预杂交

NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hour。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。

美国UVP分子杂交箱温度控制精度在±0.1℃，为您的实验成功提供最有力的保障

2. 杂交

倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。

七、洗膜与检测

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：

2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。

在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。

影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

常见问题

Q1：探针标记物的分类有几种？
A1：（1）探针标记物有放射性核素与非放射性物质两种。放射性核素标记敏感性高，可检测pg水平的核酸，但因不易长期保存，且存在放射性污染等问题，现已较少应用。
    （2）非放射性物质常用的有生物素、地高辛等，非放射性探针安全、稳定、操作方便并且经济，但敏感性较低，近年来，由于杂交信号检测方法的改进，检测的敏感性得到了很大提高。

Q2：怎样确定探针的浓度？
A2：总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜核酸分子杂交中放射性核素标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5-5.0 μg/ml。
Q3：如何选择核酸分子杂交的最适温度？
A3：核酸分子杂交技术最重要的因素之一是选择最适的核酸分子杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10-15 ℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30 ℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。最适复性温度：Tor =Tm–25 ℃苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35 ℃)

Q4：核酸杂交筛选寡核苷酸探针遵循哪些原则？
A4：（1）长18-50 nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。 
　  （2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异核酸杂交。 
　  （3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 
　  （4）避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。
    （5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

Q5：合成的寡核苷酸探针具有哪些优点？
A5：（1）由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如20 nt的寡核苷酸探针在浓度为100 ng/ml，靶序列为1-100 pg、1 kb片段时，达到最大程度的核酸分子杂交只需10 min，而用2 kb的克隆探针在同样条件下达到完全核酸分子杂交则需16 hour。
    （2）寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
    （3）一次可大量合成寡核苷酸探针（1-10 mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列或选择相对长的序列（＞30 nt）也可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18-40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。