来宝网移动站

选择细胞裂解物对活细胞中重组蛋白表达是很有用的，它们可以裂解真核细胞或

细菌细胞，并去除蛋白质中所有不需要表达的成分。这些裂解物可以与DNA模板其他所需成分在试管中结合，进行蛋白质的表达（1）。 

优势

1.无细胞反应很容易建立，仅需几个小时就可以完成蛋白质表达。这种方法可以用小规模（50-100微升）的反应快速完成反应条件的优化，最佳的条件能被线性放大到其所需的数量。

2.总处理量小：对于可溶性蛋白，几毫升的反应就可以得到毫克量的蛋白。

3.作为一个开放的系统，许多成分（天然的和非天然的），均可以被添加到反应混合物中，如还原/氧化元素、分子伴侣、标记的氨基酸或去污剂。如此，蛋白质可以直接用于核磁共振，也可将膜蛋白在新生状态下重组到纳米盘系统中，而无需任何人造去污剂（10-12）。

4.真核细胞的裂解物能进行翻译后修饰，如糖基化或磷酸化，并可将天然的细胞膜成分（如微粒体）插入膜蛋白（9）。

5.通常可以在无细胞系统中进行活细胞毒性蛋白的表达，由于已经去除了负责（功能）的细胞成分，所以不会受到如蛋白消化酶或DNA模板不稳定的影响。

6.多聚体蛋白和复合物都能被表达，且DNA模板滴定会影响不同亚基的比例。 劣势1.  如果蛋白质需求量大或者蛋白质表达低，无细胞表达会相当昂贵。因此，对于每一种蛋白质，应在小规模实验中评估可达到的产量，并计算放大的成本，这对来自真核生物更复杂的无细胞裂解物来说更应如此。

表1  不同无细胞表达系统的比较

应用由于蛋白质是在一个开放性的系统中表达的，与活细胞表达相比，无细胞表达使许多应用受益，包括：·  表达筛选：通过无细胞表达，您可以在两天内从DNA模板-甚至是多个平行反应得到免疫印迹的结果，这使得该系统对于快速筛选多个构建体和反应条件更具吸引力。·  蛋白标记：开放式系统可以与标记的氨基酸相结合，例如生物素或荧光标签。·  核磁共振：可以很容易地将同位素标记的氨基酸添加到混合物中，获得准备用于核磁共振的蛋白质。·  结晶：与硒代蛋氨酸结合，在一个简单的步骤中获得蛋白质重金属衍生物。 膜蛋白特殊的适应性由于蛋白质是在一个开放的系统中表达的，与活细胞表达相比，无细胞表达促进了许多应用，包括：·  不溶性表达：在不添加任何种类的脂质或去污剂的情况下，形成膜蛋白聚集体，在诸多情况下可以重新折叠成功能蛋白。·  去污剂：尤其是Brij系列的去污剂，多数情况下将其加入以溶解膜蛋白。如果需要，可以在后续步骤中交换去污剂，但最好是在纯化过程中。(2-7)·  纳米磷脂盘：在无细胞反应中加入纳米磷脂盘，是获得稳定性蛋白质最简单和最简便的方法，不需要去污剂，可用于各种检测（10-15）。其应用范围包括生物物理学分析、表面等离子共振、核磁共振和冷冻电镜的质谱分析。最近有研究表明，通过纳米磷脂盘，膜蛋白在无细胞裂解物中的表达可通过中观方法进行结晶（14），了解更多关于纳米磷脂盘的信息。·  脂质体和其他脂质颗粒：如脂质体、微粒体和其他含脂质的结构（如双层膜微胞），已被添加到无细胞反应中，尤其是与昆虫细胞裂解物结合进行膜蛋白的表达（9）。使用适量的去污剂，还可以将膜蛋白从纳米磷脂盘转移到双层膜微胞中（13）。 间歇式和无细胞持续交换方法通常可按两种方法进行无细胞反应：1.  间歇式：可以轻松的在简易管中进行间歇式无细胞反应，如离心管。其反应时间很短（1-3小时），因为能量物质很快就被消耗完了，而最终产物的积累会减缓酶促反应的速度，因此蛋白质的产量通常会很低。2.  无细胞持续交换或半透膜：无细胞持续交换（CECF）反应是通过半透膜进行的，所以可向反应提供能量物质，并去除最终产物，如ADP。如此，反应时间就可以达到24小时，对于表达量高的可溶性蛋白质，蛋白质每毫升的产量可以达到几毫（8）。   

参考文献：

1. Endo, Y., et al. (eds) Cell-Free Protein Production, Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 607, 2010.2. Boland, C. et al. Cell-free expression an in meso crystallization of an integral membrane kinase for structure determination. Cell. Mol. Life Sci (2014) DOI: 10.1007//s00018-014-1655-7.3. Hein, C. et al. Hydrophobic environments in cell-free systems: Designing artificial environments for membrane proteins. J. Eng. Life Sci. (2014), 14, 365-79.4. Proverbio, D., et al. Membrane protein quality control in cell-free expression sysems: Tools, strategies and case studies. Membrane proteins production for structural analysis (Isabelle Mus-Veteau, ed.) Springer Heidelberg. ISBN:978-1-4939-0662-8.5. Haberstock, S. et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Prot. Exp. Purific. (2012) 82, 308-16.6. Matthies, D, et al. Cell-free expression and assembly of a macromolecular membrane protein complex. J. Mol. Biol. (2011) 413, 593-603.7. Schneider, B. et al. Membrane protein expression in cell-free systems. Metho. Mol. Biol. (2010) 601, 165-86.8. Schwarz, D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in E.coli based continuous exchange cell-free systems. Nat. Protocols (2007) 2, 2945-57.9. Sachse, R. et al. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Lett. (2014), 588,2774-2781.10. Roos, C. et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E.coli MraY translocase. Biochim. Biophys. Acta (2012) 1818; 3098-3106.11. Proverbio, D. et al. Functional properties of cell-free expressed human endothelin A and endothelin B receptors in artificial membrane environments. Biochim. Biophys. Acta (2013) 1828, 2182-92.12. Roos, C. et al. High-level cell-free production of membrane proteins with nanodiscs. In: Cell-free Protein Synthesis: Methods and Protocols. Alexandrov, K., and Johnston, W.A. (eds), Methods in Molecular Biology (2014), vol. 1118, Chapter 7.13. Laguerre, A. et al. From nanodiscs to isotropic bicelles: A procedure for solution nuclear magnetic resonance studies of detergent-sensitive integral membrane proteins. Structure (2016) 24, 1-12.14. Nikolaev, M. et al. Integral membrane proteins can be crystallized directly from nanodiscs. Cryst. Growth Des. (2017) 17(3), 945–948.15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife (2017) 6:e20954.