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膜蛋白研究利器;
Rho1D4亲和纯化体系+Nanodiscs(纳米磷脂盘)

 
在人体蛋白中有大约30%是膜蛋白，膜蛋白在细胞进行物质、信息、能量交换中发挥着重要作用，膜蛋白也成为大多数重要的药物研究对象和靶点。ＦＤＡ批准的新药中就有绝大多数都以膜蛋白为靶点，几乎所有的膜蛋白都是研究热点。然而让人吃惊的是，乐观估计，目前已经被透彻研究清楚结构的膜蛋白仅占膜蛋白总量的1%。究其原因，是因为膜蛋白依附或横跨在细胞膜的磷脂双分子层上，使膜蛋白的表达、纯化、结晶和结构分析都有很大难度。市面上有一些专用于膜蛋白提取的试剂盒，大多数只能提取某几种类型的膜蛋白，有些试剂盒用于提取膜总蛋白（包括质膜和细胞器膜蛋白）。

现在，德国Cube Biotech公司推出了一种新型膜蛋白提取工具能够特异性亲和纯化重组膜蛋白，同时具有高纯度、高特异性、高载量、温和提取的特点，可以更好地帮助科研人员想深入研究膜蛋白，进而攻克困扰人类的各种疾病。这种技术是基于1980年科学家在牛眼视网膜中发现的一种命名为Rho1D4的氨基酸序列以及其对应的抗体来作为亲和标签纯化膜蛋白取得了非常好的效果，将Rho1D4抗体链接在琼脂糖或磁珠上，用于亲和层析带有Rho1D4标签的膜蛋白。

Rho1D4特异性亲和纯化重组膜蛋白产品系列（琼脂糖/磁珠）

当膜蛋白被成功提取出后需要对其结构及功能的研究。由于膜蛋白存在疏水部分，因此在体外容易聚合，所以需要找到一种合适的方法让膜蛋白能够稳定地存在于细胞外的环境。传统的膜蛋白提取后都保存在去污剂中，但自然条件下作为“镶嵌”在细胞膜磷脂双分子层中的蛋白一旦脱离了其稳定的天然膜环境，便会对其生理功能的发挥产生不同程度的影响甚至受到完全的破坏。Cube Biotech公司的

Nanodiscs试剂盒可以解决分离出的膜蛋白在体外环境中稳定存在的问题，保证膜蛋白能够像在天然的细胞膜中维持其构象和生物学功能，使其在有利的条件下用于后续的功能研究。

Cube Biotech Nanodiscs试剂盒系列产品

早在上个世纪90年代，来自University of Illinois的生化学家Stephen Sligar教授就提出了命名为“Nanodisc”的磷脂层结构。Nanodiscs这种膜蛋白提取工具打破了原有提取方法的瓶颈，能够高效而温和地辅助于膜蛋白的提取和保持其构象，这种膜蛋白提取辅助工具可以解决传统提取方法容易出现的问题。

目前，Rho1D4纯化体系和Nanodiscs在膜蛋白提取和研究方面已经应被全球许多著名的科研院校、制药企业所采用和青睐。无论是两种技术的配合使用或是单独使用都很好地推动了膜蛋白相关领域的研究进展。本文将对这两种技术有更详细的解读与应用说明。
 
 
 
 
Rho1D4体系和Nanodiscs的技术解读与应用说明
 
一、      Rho1D4体系：反应条件温和的高特异性亲和纯化方法
1)   什么是Rho1D4?
Rho1D4是指在牛眼视网膜细胞内的牛视紫红质C端的最后九位氨基酸。Rho1D4得名于与该序列特异性结合的单克隆抗体1。与Rho1D4抗体结合的表位可以作为针对膜蛋白的超高特异性纯化标记。

通过基因修饰可在欲研究的目标（膜）蛋白C端加上Rho1D4标记（如图1）。一旦加载上该序列，即可用装载有Rho1D4抗体的亲和基质去捕获目标蛋白，随后添加Rho1D4肽，通过竞争性结合基质抗体的方式来洗脱目标蛋白。采用这种方法，相比改变pH值等其他洗脱方式，更加地温和。

2)    Rho1D4的历史
Rho1D4的表位和抗体配对最早于20世纪80年代被发现，当时科学家将Rho1D4抗体交联包被在琼脂糖凝胶上，用来纯化通过猴肾细胞表达的牛视紫红质。1,2从那时起，Rho1D4系统开始被广泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶联受体），ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶质反向转运体和以及一种含四个跨膜域的膜蛋白。
 
3)   Rho1D4系统的优势和用途
l  高特异性且高纯度
Rho1D4系统包含：标签、抗体偶联亲和基质（琼脂糖或磁珠等）以及洗脱多肽。Rho1D4系统的最大优势在于抗体与抗原相互作用的高度特异性。表位序列和链长对结合至关重要，例如：将第三位丙氨酸替换成甘氨酸，即移去一个甲基基团，抗体将不再与表位结合。同样，完整的九个氨基酸标签会与Rho1D4抗体结合紧密，去除两个氨基酸则阻断结合。因此，含有与Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特异性结合被最小化，因此回收蛋白的纯度非常高。（见表1） 3,4,5,6,7,8

l  高回收量
而Rho1D4系统的另一个优势是洗脱目标蛋白的高回收率。包括细菌，酵母和哺乳动物细胞系在内的表达系统已经针对特定的GPCR和其他膜蛋白进行了优化。用Rho1D4系统纯化后的膜蛋白通过凝胶过滤以除去用于洗脱的多肽。使用此纯化系统的科研人员均反馈蛋白回收量均达到毫克级。（见表1）3,4,5,6,7,8

l  纯化的膜蛋白可用于功能性研究
纯化的蛋白可用于功能性研究（配体结合的特性、蛋白与蛋白间的相互作用等）。

例1：将标记过的ABCA4固定在载有Rho1D4抗体的基质上来确定它与天然配体（一种视网膜的加成物）的亲和结合特性，加入ATP后即释放2。

例2：CD81蛋白被整体固定在涂有Rho1D4抗体的平板上，它表现出和分离可溶蛋白片段与丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的亲和结合力3。
另外，有阴离子转运载体AE1结构域的重组蛋白被标记且用Rho1D4系统纯化后表现出与红细胞来源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
 

4)   利用Rho1D4纯化膜蛋白图解简述

图2：Rho1D4纯化膜蛋白示意图

表1：膜蛋白应用实例

*纯度是从低浓度经一步Rho1D4 IAC在反应溶液中得出的；产率是在洗脱成分浓缩并过SEC柱后计算的。
表1：有文献报道的使用Rho1D4系统纯化膜蛋白的纯度和产率。尽管很多用Rho1D4系统纯化的膜蛋白均为G蛋白偶联受体家族，该系统也可以有助于辨别其他如转运体之类的膜蛋白。相关文章在参考文献中。IAC：免疫亲和层析；SEC：排阻层析。

二、      Nanodiscs：还原细胞膜环境的人造磷脂双分子层
 
1）  什么是Nanodiscs
 
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。通过这种特殊的结构，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持膜蛋白生物学活性，为膜蛋白研究提供了充分的技术支持，科研人员便可以在有利的条件下继续开展后续的功能研究。
             

膜支架蛋白(MSPs)是载脂蛋白(apo) A-I的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而形成圆盘状的结构，即纳米盘3。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同时在没有去污剂的情况下也可以使膜蛋白溶解。

图3：膜蛋白组装到Nanodiscs的原理图。绿色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
 
 
根据所使用的MSPs的不同，形成的Nanodiscs的直径会有所差异，这些纳米级双层微粒的直径约为7-13纳米。应用广泛的MSPs包括MSP1D1、MSP1D1-dH5和MSP1E3D1，具体尺寸见表1。
 

表2 ：不同类型的MSPs的尺寸

2） 为什么选择Nanodiscs
 
在膜蛋白研究方面，尤其是配体结合研究、构象动力学分析以及蛋白相互作用的研究，Nanodiscs体系与其他体系相比有诸多优势4。Nanodiscs可以使膜蛋白，如GPCRs或转运蛋白等，在人造环境里和纳米盘重新组装起来，形成类似天然的细胞膜结构。这种组装到Nanodiscs中的可溶性蛋白可以在没有去污剂的情况下用常规的层析方法来进行纯化。Nanodisc与膜蛋白的组装结构使得膜蛋白能够在体外研究膜蛋白在生理上细胞内和细胞外的两面，因此也使得进一步研究拮抗剂、激动剂、G蛋白以及其它相互作用的配体不再受限。
 
3） Nanodiscs优势：
 
l  Nanodiscs 能够为提取出来的膜蛋白提供一个稳定环境使它们继续工作，就好像还没有离开原来细胞膜一样。 细胞膜蛋白之所以研究难度大是在于膜蛋白从细胞膜上提取出来以后就无法行使其正常功能，使得研究这些受体分子相当困难。为了解决这个难题，Stephen Sligar 等科学家研发出一种脂质纳米圆盘 (lipid-based Nanodiscs)可以替代细胞膜上磷脂双层膜 (phospholipid bilayer)，让被纯化出来的细胞膜蛋白如同一般细胞膜蛋白一样稳定地行使其正常功能。

l  Nanodiscs 和天然细胞膜的组成结构一样，是由两层磷脂层组成，每个磷脂分子都有活跃并亲水的头部基团和疏水尾部。Nanodiscs 的结构就像一般细胞膜一样，由两层背对背的磷脂 (phospholipid)所组成，为了使纳米圆盘表面能保持这个扁平的形状，研发人员为这个Nanodiscs 外面加上一圈蛋白质(MSPs)。

l  Nanodiscs 应用前景非常广泛，这个技术将有助于解开一大堆未知的膜蛋白的生化行为模式，也将帮助得到膜蛋白的结晶，从而应用X 射线晶体衍射学获得在原子水平上的结构图。
 

4）将膜蛋白组装到Nanodiscs中的两种方法：
 
方法1：组装溶解在去污剂中的膜蛋白
在适合去污剂存在下，将膜蛋白溶解并纯化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能够自发地组装，在去除掉表面活性剂后可以通过凝胶过滤（排阻层析）等方式来纯化。

方法2：Nanodiscs与无细胞表达体系相结合
另一个方法是，膜蛋白在无细胞表达体系中被表达，通过加入已经和膜蛋白结合预先组装的Nanodiscs，膜蛋白能通过无细胞表达系统表达出来。采用这种方法，就无需再添加去污剂，在最大程度上降低了人为添加试剂对最终结果的影响。
虽然通过无细胞表达体系会将蛋白的产量限制在微克级别，但这种方式却为蛋白修饰、生物素酰化或同位素标记等研究手段提供了更多发展方向的可能性。

图4：膜蛋白与Nanodisc的两种组装机制

左图：膜蛋白（橙色）溶解在去污剂（深灰色）中并与冻干的MSP（绿色）和磷脂（浅灰）混合。然后去除去污剂，形成蛋白-Nanodisc复合物。
右图：预组装了MSP与磷脂的Nanodiscs加入到无细胞反应液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能够自发地组装到Nanodiscs中。
 

5） Nanodiscs的应用
 
Nanodiscs为膜蛋白在体外提供了非常稳定的环境，并可以在这个环境下研究配体的结合，或用NMR和SPR研究拮抗剂与激动剂。MSPs可以与组氨酸标签结合来促进纯化、检测和固定化。

Nanodiscs其它方面的应用还包括共振拉曼（resonance Raman）、低温电子显微学（Cryo-EM）、MALDI 、蛋白活性研究和时间分辨荧光光谱。将抗原组装

Nanodiscs中已经被用来提高小鼠的免疫反应，说明其具备用于制备疫苗和生产抗体的极大潜能。
最近，大肠杆菌全细胞膜蛋白组被组装到了Nanodiscs中，为以后的研究构建了一个可溶解的膜蛋白信息库。更多Nanodiscs的应用请参见表3。
 

表3 :Nanodiscs应用举例

图5：纳米磷脂盘包裹膜蛋白研究实例（来源：Sligar Lab）

 
在过去几年里，业内已经发表了多篇关于Nanodiscs的应用文献，例如：Nanodisc系列产品MSP1D1-His和MSP1D1dH5-His的应用已刊登在《美国化学会-应用材料与界面》（ACS Applied Materials & Interfaces），Cube Biotech首席科学家 Dr. Barbara Maertens、法兰克福大学生物物理化学研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊联合发表文章并提出Cube Biotech的Nanodisc试剂盒是有效用于研究膜蛋白结构/功能的新工具。目前，许多研究人员正在利用Nanodiscs研究出更多与之相关的技术与应用。

图6：有关Nanodiscs的文献发表情况。从2003—2013年，利用Nanodiscs进行膜蛋白研究的相关报道在不断增加。（来源：PubMed）
 

 
 
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