SEPMAG eBooks-The advanced guide to biomagnetic protein purification

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目前大多数蛋白质纯化方法都使用带有亲和功能的琼脂糖珠，例如IM谷胱甘肽或抗体。这些官能团的选择取决于要纯化的目标蛋白质，并且种类繁多，包括可以与生物分子偶联的预官能化磁珠（请参阅蛋白质纯化电子书第4和5章）。

琼脂糖常用作蛋白质纯化的基质，其原因有两个。首先，琼脂糖显示出与蛋白质非常低的非特异性结合，从而提高了洗脱的蛋白质组分的纯度。其次，琼脂糖颗粒整体上由亲水的三维网状结构组成，其大小足以使蛋白质扩散。该网孔首先使生物分子能够与琼脂糖颗粒的外壳相互作用，从而在官能团和目标蛋白质之间提供较大的相互作用比表面，并提高在蛋白质纯化中可获得的产量。

琼脂糖基质既可以是非磁性的，也可以是利用磁铁矿（Fe3O4）核来使其具有磁性的。非磁性琼脂糖微球通常比磁性微球大（直径40-150μm），以降低色谱中的背压。磁珠通常较小（直径为2-40微米）。较小的微球可提供更多的表面积，因此与目的蛋白质有更强的相互作用。然而，为了获得最佳磁性，应使用的最小尺寸为10μm的磁珠，特别是在使用亚铁磁珠时（见SEPMAG®蛋白质纯化电子书第12章）。

为了获得最大的灵活性、磁性和非磁性材料之间的亲和功能以及表面化学性质应相同，以便在两个系统之间轻松切换。

非磁性和磁性琼脂糖珠之间的主要区别是它们与周围介质的分离方式。在第一个纯化步骤中，该培养基可以是细菌或细胞裂解液，细胞培养基或任何种类的生理缓冲液。在蛋白质纯化的洗涤和洗脱步骤中，该培养基包含了具有不同特性（例如盐浓度、pH）的缓冲液，这些缓冲液会诱导特定蛋白质的结合，污染物的去除和目标蛋白质的洗脱。这些溶液的粘度也可以变化，例如当添加甘油等物质以减少非特异性结合时。每个蛋白质纯化过程都需要几个分离步骤，因此有效的分离对处理时间和纯化的成功都有很大影响。

对于所有蛋白纯化实验，重要的是将亲和微球的量调整至与起始材料中蛋白的量相匹配。这不仅因为成本原因很重要：亲和力基质太少会导致溶液中蛋白质的不完全结合。另一方面，过多的亲和力结合位点将导致其他蛋白的结合，从而使纯化的特异性降低，因此就需要额外的纯化步骤才能获得较纯的蛋白。

非磁性琼脂糖珠可以通过离心，在重力柱中或在色谱系统上通过过滤从培养基中分离出来。在这些方法之间切换（例如当使用更高的纯化规模时）需要进行优化。当蛋白质表达水平低时，需要将大量的起始材料应用于相当少量的琼脂糖微球，这可能是一个耗时的过程。对于仅需要微升体积且非常敏感的应用（例如免疫沉淀），分离可能会不完全，从而导致材料损失或琼脂糖微球污染。

图 2. IDA 与 NTA 螯合配体次氮基三乙酸（NTA）和亚氨基二乙酸（IDA）提供多聚组氨酸标签的 Ni² +  和咪唑环之间的相似相互作用，但 NTA 使 Ni² + 具有 4 个价态而IDA 仅具有 3 个（橙色圆圈）。这种差异会影响所得纯化蛋白级分的质量。

对于磁珠，无论应用和体积如何，分离原理都是一样的。测试反应或免疫沉淀等敏感应用可以在几微升内完成，甚至可以在微升机器人上实现自动化。从数升培养基或细胞裂解液中纯化蛋白质同样可以做得很好，因为在第一步分离后处理量显著减少。

更多信息请访问：http://www.cube-biotech.com/s-products/mag-beads

作者：德国Cube Biotech公司运营总监 Roland Fabis博士http://www.cube-biotech.com/scompany/management-team

Roland Fabis博士在德国明斯特大学获得无机化学博士学位，他在那里研究有机硅化合物，硅烷的表面改性以及这些物质的应用。Fabis博士于1995年加入位于德国希尔登的QIAGEN总部，在基础研究，产品开发和技术转让（尤其是磁性粒子合成和蛋白质纯化领域）中担任过多个职位。他也是Cube Biotech的共同创始人之一，负责蛋白质亲和材料的开发和生产，包括磁珠的生产。

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