来宝网 2023/7/26点击316次
D-荧光素是流行的多功能生物发光底物，也是比较常见的实验试剂，下面请跟着百萤一了解D-荧光素钾盐的实验过程吧!
一、D-荧光素钾盐和5-氟-荧光素，作为Luciferase的作用底物，常用于以下实验：
1. 报告基因分析
2. In vivo imaging (动物活体成像)
3. In vitro imaging (细胞体外分析)
4. ATP测定
5. 其它luciferase及其基因相关的分析和研究工作
二、实验方案
以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。
1.用于体外生物发光图像测定的实施方案
1.1在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。混合均匀。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。
1.2在预热的组织培养基中制备0.5-1mM D-荧光素的工作溶液。
1.3从培养细胞中分离培养基。
1.4将荧光素工作溶液加入细胞中，并在成像前将细胞在37°C孵育5-10分钟。
2.用于体内生物发光图像测定的实施方案
2.1在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液，不含Mg2+和Ca2+。 混合均匀。
2.2过滤器通过0.2μm过滤器过滤溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。
2.3在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像前10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。
注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。
3.荧光素报告分析分子测定的实施方案
3.1在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。
3.2制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。
3.3将5-10μl细胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。
3.4根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液的普利光度计。
3.5注入200μl荧光素工作溶液，无延迟，10秒积分时间。
注意1：D-荧光素钾盐溶于无菌水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并在-20°C下避光储存。必须用适当的碱中和游离酸溶解。
注意2：D-荧光素可与任何现有的文献或ATP分析系统一起使用。
注意3：如果检测ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。仅使用无菌无ATP水和试剂。使用高压水进行所有试剂制备。
三、试剂应用文献
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Cytotoxicity Burst? Differentiating Specific from Nonspecific Effects in Tox21 in Vitro Reporter Gene Assays
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IL4I1 is a metabolic immune checkpoint that activates the AHR and promotes tumor progression
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Genome-wide microRNA analysis identifies miR-188-3p as novel prognostic marker and molecular factor involved in colorectal carcinogenesis
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C3-Luc Cells Are an Excellent Model for Evaluation of Cellular Immunity following HPV16L1 Vaccination
Authors: Li, Li-Li and Wang, He-Rong and Zhou, Zhi-Yi and Luo, Jing and Wang, Xiao-Li and Xiao, Xiang-Qian and Zhou, Yu-Bai and Zeng, Yi
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Identification of a novel protein kinase a inhibitor by bioluminescence-based screening
Authors: Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal: Biological and Pharmaceutical Bulletin (2015): 1969--1974
Identification of a Novel Protein Kinase A Inhibitor by Bioluminescence-Based Screening
Authors: Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal: Biological and Pharmaceutical Bulletin (2015): 1969--1974
