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钙黄绿素（Calcein AM）是用于标记和监测活细胞细胞功能的最流行的荧光探针之一。但，Calcein AM的有限颜色选择及其与GFP的完全光谱重叠使得这种试剂无法用于多色分析。

百萤生物为您推荐AAT Bioquest研发的Calcein Red?，Calcein Orange?和CytoCalcein?它们可以用于多重细胞功能分析，颜色多样。它们在进入活细胞时，才会表现出强烈的荧光。Calcein Red?，Calcein Orange?和CytoCalcein?是疏水性化合物，可轻易渗透完整的活细胞，并在细胞内酯酶诱导的水解后产生各自的细胞保留的荧光团。通过流式细胞术，荧光酶标仪和荧光显微镜获得一致的结果。即使在Jurkat细胞中染色加载2周后，Calcein Orange?和CytoCalcein?也具有最小的细胞毒性，而在用相同浓度的钙黄绿素AM染色加载3天后，所有细胞都是凋亡/坏死的。

材料与步骤

1.将CHO-M1，CPA和Jurkat细胞在37℃，5％CO 2培养箱中在96孔黑壁/透明底板中铺板过夜。

2.染料加载：孵育过夜后，除去培养基。 2-5μM钙黄绿素，AM（Cat＃22004），Calcein Orange?（Cat＃22009），Calcein Red?（Cat＃22010），Calcein blue，AM（Cat＃22007），CytoCalcein?Violet 450（Cat＃22012） 将100μL含有20mM HEPES的1X HBSS中的CytoCalcein?Violet 450（Cat＃22012）加入每个孔中。 将细胞在37℃下染色15至30分钟。 在染料加载后，用缓冲液洗涤细胞两次。

3. 在荧光显微镜（Olympus IX71），BMG NOVOstar酶标仪或FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）上进行实验。

结果分析

图1.用不同钙黄绿素染色的96孔Costar黑墙/透明底板中的CPA细胞图像。 A：Calcein，AM（FITC），B：Calcein Orange?（TRITC），C：Calcein Red?（Cy5），D：Calcein blue，AM（DAPI），E：CytoCalcein?Violet 450（Ex / Em = 405 / 450nm，405紫罗兰），F：CytoCalcein? Violet 500（Ex / Em = 405 / 500nm，405紫罗兰）。

图2.用Calcein AM，Calcein Orange?，Calcein Red?和CytoCalcein?测量Jurkat细胞数反应。 将0至50,000个细胞/孔/100μL的Jurkat细胞接种在96孔黑色壁/透明底Costar板中。 将细胞与每种5μM的钙黄绿素一起在37℃温育1小时。 在Ex / Em = 490 / 525nm（A，Calcein，AM），485 / 540nm（B，Calcein Orange?），590 / 670nm（C，Calcein Red?）和405/450下测量荧光强度。 nm（D，CytoCalcein?Violet 450），使用NOVOstar仪器（来自BMG Labtech）

图3.钙黄绿素，AM和Calcein Red?在CPA细胞上的光漂白比较。 将CPA细胞以30,000个细胞/孔接种在96孔Costar黑壁/透明底板中过夜，将2-5μM钙黄绿素，AM或Calcein Red?在37℃，5％CO 2培养箱中孵育30分钟。 用标准荧光显微镜（Olympus IX71）测量荧光强度与时间的关系。 A和B：Calcein，AM在0和120秒曝光时间（FITC）C和D：Calcein Red?在0和120秒曝光时间（Cy5）。

图4.钙黄绿素，AM和Calcein Orange?对Jurkat细胞的细胞毒性作用的比较。 将Jurkat细胞用5μM的钙黄绿素，AM或Calcein Orange?在37℃，5％CO 2培养箱中染色30分钟，然后用生长培养基洗涤。 将载有染料的细胞在37℃，5％CO 2培养箱中培养3天。 在染料加载后每天用标准荧光显微镜（Olympus IX71）测量荧光强度.A和B：钙蛋白，在染料加载后第1天和第3天的AM（FITC）C和D：钙黄绿素橙 染料加载后第1天和第3天（TRITC）。

图5.通过钙黄绿素AM，CytoCalcein ?Violet 450，Calcein Orange?和Calcein Red?监测的CPA细胞细胞毒性的比较。 将CPA细胞用25％乙醇处理30分钟，然后使用未处理的对照染料加载不同的染料。 用NOVOstar酶标仪（BMG Labtech）读取荧光。

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