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INTRODUCTION

Interleukin-8 (IL-8) is a chemokine produced by macrophages and other cell

types   such   as   epithelial   cells.   It   is   also   synthesized   by   endothelial   cells,

which store IL-8 in their storage vesicles, the Weibel-Palade bodies. There

are   more   receptors   of   the   surface   membrane   capable  to   bind   IL-8.   The

protein encoded by this gene is a member of the CXC chemokine family.

This chemokine is one of the major mediators of the inflammatory response.

This    chemokine       is  secreted     by   several     cell  types.    It  functions    as   a

chemoattractant, and is also a potent angiogenic factor. Primary function of

IL-8    is  the   induction    of  chemotaxis       in  its  target   cells  (e.g.   neutrophil

granulocytes). In neutrophils series of cell-physiological responses required

for   migration   and   its   target   function   phagocytosis  are   also   induced   like

increase       of   intracellular    Ca2+,     exocytosis      (e.g.   histamine      release),

respiratory burst. IL-8 can be secreted by any cells with toll-like receptors

which are involved in the innate immune response. IL-8’s primary function is

to recruit neutrophils to phagocytose the antigen which trigger the antigen

pattern toll-like receptors. When first encountering an antigen, the primary

cells   to   encounter   it   are   the   macrophages   who   phagocytose   the   particle.

Upon processing, they release chemokines to signal other immune cells to

come in to the site of inflammation. IL-8 is one such chemokine. It serves as

a chemical signal that attracts neutrophils at the site of inflammation, and

therefore is also known as Neutrophil Chemotactic Factor.

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The     microtiter   plate   provided     in  this  kit  has   been    pre-coated      with   an

antibody   specific   to   IL-8   Standards   or   samples   are  then   added   to   the

                                                2

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appropriate      microtiter    plate   wells   with   a   biotin-conjugated       polyclonal

antibody preparation specific for IL-8 and Avidin conjugated to Horseradish

Peroxidase (HRP) is added to each microplate well and incubated. Then a

TMB   (3,3’5,  5’  tetramethyl-benzidine)   substrate   solution   is added to   each

well.   Only   those   wells   that   contain   IL-8,   biotin-conjugated   antibody   and

enzyme-conjugated           Avidin     will   exhibit    a    change      in   color.    The

enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid

solution   and   the   color   change   is   measured   spectrophotometrically   at   a

wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of IL-8 in the samples is

then   determined   by   comparing   the   O.D.   of   the   samples   to   the   standard

curve.

DETECTION RANGE

31.2pg/ml-2000   pg/ml.   The   standard   curve   concentrations   used   for   the

ELISA’s   were   2000   pg/ml,   1000   pg/ml, 500 pg/ml,   250  pg/ml,   125  pg/ml,

62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml.

SPECIFICITY

This assay recognizes recombinant and natural human IL-8 No significant

cross-reactivity or interference was observed.

SENSITIVITY

The minimum detectable dose of human IL-8 is typically less than 7.8 pg/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection (LLD) was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

                                              3

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MATERIALS PROVIDED

               Reagent                                         Quantity

               Assay plate                                          1

               Standard                                             2

               Sample Diluent                                  1 x 20 ml

               Biotin-antibody Diluent                         1 x 10 ml

                HRP-avidin Diluent                             1 x 10 ml

               Biotin-antibody                                 1 x 120μl

                HRP-avidin                                     1 x 120μl

                                                               1 x 20 ml

               Wash Buffer

                                                            (25×concentrate)

               TMB Substrate                                   1 x 10 ml

               Stop Solution                                   1 x 10 ml

STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used

    throughout      the  expiration    date  of  the   kit,  provided   it  is  stored  as

    prescribed above. Refer to the package label for the expiration date.

2.   Opened test plate should be stored at 2-8°C in the aluminum foil bag

    with desiccants to minimize exposure to damp air. The kits will remain

    stable until the expiring date shown, provided it is stored as prescribed

    above.

3.   A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

                                             4

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REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash Buffer         If crystals have formed in the concentrate, warm up to

     room   temperature   and   mix   gently   until   the   crystals  have   completely

     dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or

     distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard        Centrifuge   the   standard   vial   at   6000-10000rpm   for      30s.

     Reconstitute      the  Standard       with   1.0   ml  of  Sample      Diluent.     This

     reconstitution     produces     a   stock   solution   of  2000    pg/ml.   Allow    the

     standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to

     making   serial     dilutions.  The    undiluted    standard    serves    as  the   high

     standard      (2000    pg/ml).   The   Sample       Diluent    serves    as   the  zero

     standard (0 pg/ml). Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours

     and discard after use.

3.   Biotin-antibody          Centrifuge    the   vial  before   opening.    Dilute   to  the

     working       concentration        using     Biotin-antibody          Diluent(1:100),

     respectively.

4.   HRP-avidin        Centrifuge the vial before opening. Dilute to the working

     concentration using HRP-avidin Diluent(1:100), respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

             eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

OTHER SUPPLIES REQUIRED

      Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

     the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

                                              5

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      Pipettes and pipette tips.

      Deionized or distilled water.

      Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

      An incubator which can provide stable incubation conditions up to

     37°C±0.5°C.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Serum      Use a serum separator tube (SST) and allow samples to clot

     for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove

     serum and assay immediately or aliquot and store samples at -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

     Plasma        Collect    plasma     using    citrate,  EDTA,     or   heparin    as   an

     anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of

     collection.   Assay   immediately   or   aliquot   and   store  samples   at   -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

     Cell Culture Supernates            Remove particulates by centrifugation and

     assay immediately or aliquot and store samples at -20° C. Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

ASSAY PROCEDURE

Bring    all  reagents    and   samples     to  room    temperature    before     use.   It  is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

All   the   reagents   should   be   added   directly   to   the   liquid   level   in   the   well.   The

pipette should avoid contacting the inner wall of the well.

                                              6

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 1.   Add   100μl   of   Standard,   Blank,   or   Sample   per   well.   Cover   with   the

     adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37°C.

 2.   Remove the liquid of each well, don’t wash.

 3.   Add 100μl of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate

     for   1   hour   at  37°C.    Biotin-antibody   working           solution   may     appear

     cloudy.   Warm   up   to   room   temperature   and   mix   gently  until   solution

     appears uniform.

 4.   Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total of three washes. Wash: Fill each well with Wash Buffer (200μl) and

     let   it  stand for  2  minutes, then   remove   the   liquid  by flicking  the  plate

     over a sink. The remaining drops are removed by patting the plate on a

     paper   towel.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good performance.

 5.   Add   100μl   of  HRP-avidin   working   solution   to   each   well.   Cover   the

     microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.

 6.   Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

 7.   Add 90μl of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at

     37°C.     Keeping     the   plate    away    from    drafts   and    other   temperature

     fluctuations in the dark.

 8.   Add    50μl   of  Stop     Solution   to    each    well   when    the   first   four  wells

     containing the highest concentration of standards develop obvious blue

     color. If color change does not appear uniform, gently tap the plate to

     ensure thorough mixing.

 9.   Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

                                                 7

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CALCULATION OF RESULTS

Using   the   professional   soft   "Curve   Exert   1.3"   to   make   a   standard   curve   is

recommended, which can be downloaded from our web.

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter logistic (4-PL) curve-fit. As an alternative, construct a standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

IL-8 concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be

determined       by    regression     analysis.    This   procedure      will  produce      an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration       read   from   the   standard    curve    must   be  multiplied     by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      It is important that the Standard Diluent selected for the standard curve

     be consistent with the samples being assayed.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Standard Diluent and repeat the assay.

      Any    variation    in  Standard      Diluent,    operator,    pipetting    technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

                                               8

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      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all   factors   have    been    tested    in  the   Quantikine     Immunoassay,         the

     possibility of interference cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

      Centrifuge vials before opening to collect contents.

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate Solution should remain colorless or light blue until added to

     the    plate.   Keep    Substrate     Solution    protected     from    light.  Substrate

     Solution   should   change   from   colorless   or   light   blue   to   gradations   of

     blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

                                                9

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             人白介素人白介素8(IL-8/CXCL8)酶联免疫分析酶联免疫分析

             人白介素人白介素                         酶联免疫分析酶联免疫分析

                          试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书

                          试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用本试剂盒仅供研究使用

本试剂盒仅供研究使用本试剂盒仅供研究使用

产品编号产品编号：：CSB-E04641h

产品编号产品编号：：

检测范围检测范围：：31.2 pg/ml-2000 pg/ml,

检测范围检测范围：：

最低检测限最低检测限：：7.8 pg/ml

最低检测限最低检测限：：

特异性特异性：：本试剂盒可同时检测天然或重组的人IL-8，且与其他相关蛋白无

特异性特异性：：

交叉反应。

有效期有效期：：6 个月

有效期有效期：：

预期应用预期应用：：ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生

预期应用预期应用：：

物液体中IL-8 含量。

说明说明

说说明明

1   试剂盒保存：未开封的试剂盒应储存于2-8℃；开封后的酶标板应与干燥

    剂一起储存于铝箔袋中置于2-8℃保存。仅在此出储存条件下，产品在有

    效期内可正常使用。

2   浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3   中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4   刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实

    验结果造成任何影响。

实验原理实验原理

实验原理实验原理

     用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗IL-8 抗体的微孔中

依次加入标本或标准品、生物素化的抗IL-8 抗体、HRP 标记的亲和素，经过

彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并

在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-8 呈正相关。用

酶标仪在450nm 波长下测定吸光度 （OD 值），计算样品浓度。

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试剂盒组成及试剂配制试剂盒组成及试剂配制

试剂盒组成及试剂配制试剂盒组成及试剂配制

1.  酶联板酶联板(Assay plate )：                                      一块（96 孔）。

    酶联板酶联板

2.  标准品标准品（Standard）：                                          2 瓶(冻干品)。

    标准品标准品

3.  样品稀释液样品稀释液(Sample Diluent)：                                  1×20ml/瓶。

    样品稀释液样品稀释液

4.  生物素标记抗体稀释液生物素标记抗体稀释液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶。

    生物素标记抗体稀释液生物素标记抗体稀释液（（                            ））

5.  辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（（HRP-avidin Diluent）） 1×10ml/瓶。

    辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（（                         ））

6.  生物素标记抗体生物素标记抗体（（Biotin-antibody）：）                 1×120μl/瓶（1：100）。

    生物素标记抗体生物素标记抗体（（                  ））

7.  辣根过氧化物酶标记亲和素辣根过氧化物酶标记亲和素（（HRP-avidin）：）            1×120μl/瓶（1：100）。

    辣根过氧化物酶标记亲和素辣根过氧化物酶标记亲和素（（                ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液（（                 ））

9.  浓洗涤液浓洗涤液（（Wash Buffer ）） 1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。

    浓洗涤液浓洗涤液（（               ））

10. 终止液终止液（（Stop Solution）：）                                     1×10ml/瓶。

    终止液终止液（（                ））

需要而未提供的试剂和器材需要而未提供的试剂和器材

需要而未提供的试剂和器材需要而未提供的试剂和器材

1.  标准规格酶标仪

2.  高速离心机

3.  电热恒温培养箱

4.  干净的试管和Eppendof 管

5.  系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器

6.  蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存标本的采集及保存

标本的采集及保存标本的采集及保存

1.  血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000g 离心20 分钟，

    取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但

    应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。

2.  血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2   -   8°C

    1000 g 离心15 分钟，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于

    -20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后

    检测。

3.  细胞培养物上清：离心后取上清，上清立即用于实验，或分装后于-20°C

    保存。避免反复冻融。

注：注：标本溶血会标本溶血会影响最后检测结果影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测，因此溶血标本不宜进行此项检测。。

注注：：标本溶血会标本溶血会影响最后检测结果影响最后检测结果，，因此溶血标本不宜进行此项检测因此溶血标本不宜进行此项检测。。

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标准品的稀释原则标准品的稀释原则：：2 瓶，使用前于6000-10000rpm 离心30 秒。每

标准品的稀释原则标准品的稀释原则：：

瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上，然后反复颠倒

/搓动以助溶解，其浓度为2000   pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释2000

pg/ml,   1000   pg/ml,   500   pg/ml,   250   pg/ml,   125   pg/ml,   62.5   pg/ml,   31.2

pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15 分钟内配制，用完

丢弃，下次检测使用新鲜配置的标准品。

如配制1000  pg/ml 标准品：取0.5ml  （不要少于0.5ml）2000  pg/ml 的上述

标准品加入含0.5ml 样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以

此类推。

生物素标记抗体的稀释原则生物素标记抗体的稀释原则：：

生物素标记抗体的稀释原则生物素标记抗体的稀释原则：：

打开瓶盖前请离心，收集瓶壁上的溶液。临用前以生物素标记抗体稀释液稀

释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制 （每孔100μl），实际

配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素标记抗体加990μl 生物素标记抗体

稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则化物酶标记亲和素的稀释原则：：

辣根过氧辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则化物酶标记亲和素的稀释原则：：

打开瓶盖前请离心，收集瓶壁上的溶液。临用前以辣根过氧化物酶标记亲和

素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔

100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根过氧化物酶标记亲和素

加990μl 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用

前一小时内配制。

操作步骤操作步骤

操作步骤操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀

时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品

稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。加样时，枪头应直接对

准液面，切勿沿孔壁加样。

1   加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，

    余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于

    酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，

    37℃反应120 分钟。

    为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

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2   弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl （取1μl

    生物素标记抗体加99μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，

    在使用前一小时内配制），37℃,60 分钟。

3   温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分钟，

    200μl/每孔，甩干。

4   每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液 （同生物素标记抗体工作液）

    100μl，37℃，60 分钟。

5   温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分钟，

    200μl/每孔，甩干。

6   依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（（30 分钟内，此时肉眼可见标

                                                （（

    准品的前3-4 孔有明显的梯度蓝色，后3-4 孔显色不明显，即可终止）。

7   依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加

    入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底

    物反应时间到后应尽快加入终止液。

8   用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度 （OD 值）。 在加终止液

    后15 分钟以内进行检测。

实验备注实验备注

实验备注实验备注

1.  用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到

    管底。

2.  每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶

    液及终止液。测量时先用此孔调OD 值至零。

3.  为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上

    盖或覆膜。

4.  未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体

    工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请

    勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物

    酶标记亲和素工作液。

5.  建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法洗板方法

洗板方法洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上

铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml

注入孔内，浸泡1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。

 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

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计算计算

计算计算

请从我们的网站下载专业软件"Curve Exert 1.3"，并根据提示制作标准曲线。

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对

数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；

再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方

程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即

为样品的实际浓度。

注意事项注意事项

注意事项注意事项

1.  本操作说明适用于本操作说明适用于48T 试剂盒试剂盒，， 48T 试剂盒中酶联板试剂盒中酶联板、标准品、标准品、生物素、生物素

    本操作说明适用于本操作说明适用于        试剂盒试剂盒，，      试剂盒中酶联板试剂盒中酶联板、、标准品标准品、、生物素生物素

    标记抗体及辣根过氧化物酶标记亲和素减半标记抗体及辣根过氧化物酶标记亲和素减半。。

    标记抗体及辣根过氧化物酶标记亲和素减半标记抗体及辣根过氧化物酶标记亲和素减半。。

2.  当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

3.  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

4.  一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

5.  请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

6.  如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释

    倍数。

7.  在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

8.  底物请避光保存。

9.  不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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Notes

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