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兔基质金属蛋白(MMP-9)ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究研究使用                                    

预期应用

ELISA法定量测定兔血清、血浆、唾液、细胞培养物上清或其它相关液体中MMP-9含量。

概述

    MMP-9是基质金属蛋白酶（MMPs）家族中的一员，为Ⅳ型胶原酶，可有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原及明胶，它的异常表达与兔类许多恶性肿瘤的转移密切相关。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一种金属离子依赖的蛋白酶。MMP-9其主要功能是降解细胞外基质,参与体内多种生理及病理过程如胚胎发育、创伤修复、血管形成、炎症、肿瘤的侵润及转移、结缔组织病等。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MMP-9水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗兔MMP-9抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

1.         酶联板：一块（96孔）

2.         标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为10 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.63ng/mL，0.31 ng/mL，0.15 ng/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。

3.         样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.         检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.         检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.         检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。

7.         检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。

3.         每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。

6.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
    自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的兔MMP-9，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2．  一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3．  请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

4．  如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6．底物请避光保存。

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．有效期：6个月

3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

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