来宝网 2010/5/8点击1517次
大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
检测范围：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml
最低检测限：7.8 pg/ml
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的大鼠BDNF，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中BDNF含量。
说明
1．试剂盒保存：
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述
脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是1982年德国神经生物学家从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，因猪、大鼠、小鼠和人类的BDNF具有完全相同的氨基酸编码序列，且与神经生长因子（nerve growth factor，NGF）序列具有惊人的相似性,故被归属为神经生长因子家族成员。BNDF是由120个氨基酸组成的一种碱性蛋白，是神经营养因子家族成员之一，是由神经元的靶细胞分泌，逆向营养神经元，BNDF对神经细胞的生长发育及保护修复有重要作用,其生物学效应主要由二种类型的跨膜糖蛋白介导，一种是高亲和力受体TrKB，另一种是低亲合力神经营养素受体（LNGFR），其中TrKB是信号转导所必需的。TrKB的细胞外配体结合区与BNDF结合后可发生自磷酸化，继而发生一系列底物磷酸化反应，实现从细胞膜到细胞核的信息传递而引起细胞应答效应, TrKB主要表达在脑中。目前BDNF被认为是抗凋亡剂、抗氧化剂和钙通道阻滞剂。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗BDNF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗BDNF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的BDNF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2000 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释2000 pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。
如配制1000 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2000 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
