来宝网 2010/4/7点击1624次
猪基质金属蛋白酶(MMP-9)ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究研究使用
预期应用
ELISA法定量测定猪血清、血浆、唾液、细胞培养物上清或其它相关液体中MMP-9含量。
概述
MMP-9基因位于染色体20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13个外显子和9个内含子。哺乳类动物MMP-9mRNA的同源性约为80%。MMP-9的启动子区内含有活化蛋白(AP)-1、AP-2和刺激蛋白(SP)-1因子结合位点，猪的MMP-9启动子区还有核因子(NF)κB、ETS结合位点和转化生长因子(TGF)-β抑制元件MMPs主要由3个独特的、保守的结构域构成，包括前肽区(氨基末端区)、催化区和羧基末端区(类血红素结合蛋白酶区)。MMP-9是明胶酶中的一种，除了有MMPs的原型结构外，MMP-9的催化区还包括3个重复的型纤维连接蛋白结构域，这个结构域与明胶或弹性蛋白有高度的亲和力。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域,这个结构域有高度的糖基化作用，,它影响底物的特异性以及有抗衰变的作用。MMP-9有许多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP-9作用的底物。
MMP-9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外，在体外，MMP-9通过有机汞制剂反应才有活性，在体内则可经一系列蛋白酶级联而激活。这个胶原蛋白结构域可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解，而不是纤维蛋白溶酶、凝血酶或者MMP-1。MMP-3可能是MMP-9最有效的激活剂。MMP-9主要的循环抑制剂是а2巨球蛋白，活化的MMP-9被а2巨球蛋白捕获并通过清除受体被清除出循环系统。金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs家族的组织抑制剂，广泛分布于组织和体液中，共价结合MMPs而抑制其活性。TIMP-1作为MMP-9的抑制剂，与MMP-9的酶原或活化后酶的催化区的羧基末端特异性结合，形成复合物，,从而特异性抑制MMP-9的活性。另外，血小板反应蛋白和蛋白酶组织抑制因子2(TFPI-2)也能抑制MMP-9的活性。
MMP-9的生理作用广泛。MMP能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜,因此能参与呼吸道和肺的重建，它还能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，它能降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性,能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，并且MMP-9还能从白细胞介素8(CXCL8/CL8)上分解一个62氨基酸肽,使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP-9结合CD44可释放储存的TGF-β1，另外，MMP-9可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MMP-9水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗大鼠MMP-9抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成
1. 酶联板：一块（96孔）
2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为20000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成20000 pg/mL，10000 pg/mL ，5000 pg/mL，2500pg/mL，1250pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。
3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。
4. 抗体稀释液A：1×10ml/瓶。
5. 抗体稀释液B：1×10ml/瓶。
6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液A1：100稀释。
7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液B1：100稀释。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
标本的采集及保存
1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，
4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层
吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的猪MMP-9，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2． 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6．底物请避光保存。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．有效期：6个月
3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
厦门慧嘉生物科技有限公司专业代理众多国际生命科学领域的知名品牌。致力于各种ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒、一抗二抗、细胞因子、生物试剂、移液器、耗材的销售推广及服务工作。
咨询电话：0592-6020891 18906011628 http://www.biohj.com QQ：1284882975
