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猪白细胞介素-8（IL-8）ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究研究使用                                    

预期应用

ELISA法定量测定猪血清、血浆、细胞培养物上清、肺泡盥洗液等其它相关液体中IL-8含量。

概述

白细胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的猪单核细胞培养液上清中分离提纯的一种碱基肝素结合蛋白，具有内源性白细胞趋化和活化作用，最初命名为单核细胞源性中性细胞趋化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF），1998年被正式统一命名为中性粒细胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8属于CXC型亚家族，又因其氨基酸第一个半胱氨酸前有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸而称为ELR⁺-CXC型趋化因子。IL-8是一种可由多细胞来源的多功能趋化因子，其生物学功能无种属特异性，除具有特异性使中性粒细胞离开血流游走到炎症组织，脱颗粒，产生超氧阴离子，引起呼吸爆发外，还显示出促血管生成的活性，可参与多种恶性肿瘤的转移及血管生成。此外，IL-8对淋巴细胞和其它免疫细胞也有趋化和活化作用。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中IL-8水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-8抗原、生物素化的抗猪IL-8抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-8呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

1.         酶联板：一块（96孔）

2.         标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，充分混和后其浓度为1000pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成500 pg/mL，250 pg/mL ，125 pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6 pg/mL，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。

3.         样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.         检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.         检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.         检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。

7.         检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时后于1000 x g离心30分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：标本可采用肝素、EDTA或枸橼酸盐做为抗凝剂。标本采集后30分钟内1000 x g离心15分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。

3.         每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。

6.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
    自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测重组或天然的猪IL-8。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

灵敏度

本试剂盒测定猪IL-8的最小可检测检测浓度(MDD)，其值一般约为0.28 pg/mL

注意事项

1．  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2．  一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3．  请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

4．  如标本中IL-8含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

检测范围：

15.6 pg/mL – 1000 pg/mL

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．有效期：6个月

3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

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