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小鼠白介素6(IL-6)ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供体外研究使用!

预期应用

ELISA法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IL-6含量。

实验原理

用纯化的IL-6抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的IL-6抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（ OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1、 酶标板：一块（96孔）

2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖

好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5,000 pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 pg/ml。如配制2,500 pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3、 样品稀释液：1×20ml。

4、 检测稀释液A：1×10ml。

5、 检测稀释液B：1×10ml。

6、 检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10 检测

溶液A / 990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量

配制（100 /孔），实际配制时应多配制  0.1-0.2ml。

7、 检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检

测溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）。

11、覆膜：5张

12、使用说明书：1份

自备物品

1、 酶标仪（建议仪器使用前提前预热）

2、 微量加液器及吸头，EP管

3、 蒸馏水或去离子水，滤纸

标本的采集及保存

1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可

检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。

2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，

取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。

3、 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。

注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1周，-20 不应超过1个月，-80 不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37 溶解）；试剂或样品配制时

均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加

标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及

孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效

性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 （临用前配制），酶标板加

    上覆膜，37 温育1小时。

3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻

    拍将孔内液体拍干）。

4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制） 100 ，加上覆膜，37 温育1小时。

5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当

    标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

7、 每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物

    液的加入顺序相同。

8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

注：