来宝网 2010/1/23点击1775次
人脑源性神经营养因子（BDNF）ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究研究使用
预期应用
ELISA法定量测定人血清、细胞培养物上清或其它相关液体中BDNF含量。
概述
脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是1982年德国神经生物学家从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，因猪、人、小鼠和人类的BDNF具有完全相同的氨基酸编码序列，且与神经生长因子（nerve growth factor，NGF）序列具有惊人的相似性,故被归属为神经生长因子家族成员。BNDF是由120个氨基酸组成的一种碱性蛋白，是神经营养因子家族成员之一，是由神经元的靶细胞分泌，逆向营养神经元，BNDF对神经细胞的生长发育及保护修复有重要作用,其生物学效应主要由二种类型的跨膜糖蛋白介导，一种是高亲和力受体TrKB，另一种是低亲合力神经营养素受体（LNGFR），其中TrKB是信号转导所必需的。TrKB的细胞外配体结合区与BNDF结合后可发生自磷酸化，继而发生一系列底物磷酸化反应，实现从细胞膜到细胞核的信息传递而引起细胞应答效应, TrKB主要表达在脑中。目前BDNF被认为是抗凋亡剂、抗氧化剂和钙通道阻滞剂。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中BDNF水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入BDNF抗原、生物素化的抗人BDNF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的BDNF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板：一块（96孔）
2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。
如配制5000 pg/mL标准品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。
4. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A 1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
标本的采集及保存
1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，为进一步去除血浆中血小板，请再次2 - 8° C 1000 x g离心10分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：血小板中含BDNF，并其将会随着血小板的活化而释放入血。因此欲测定循环量BDNF量，须先尽量去除标本中血小板。
操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，
4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人BDNF，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2． 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6．底物请避光保存。
检测范围：
156 pg/mL -10000 pg/mL
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．有效期：6个月
3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
5．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
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