来宝网 2009/11/25点击2155次
小鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISA试剂盒
本试剂盒仅供体外研究使用
预期应用
ELISA法定量测定小鼠组织匀浆、血清、血浆、细胞培养上清、尿液或其它相关生物液体中8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量。
概述
DNA链上的碱基鸟嘌呤C-8位易受到羟自由基及单线态氧的攻击而发生羟化,生成加合物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)。8-OHdG是DNA氧化损伤的特异产物,是公认的内源性及外源性因素对DNA氧化损伤的生物标志物。8-OHdG是DNA氧化损伤的主要产物之一。在复制过程中,DNA链上8-OHdG可以与C以外的其它碱基配对形成点突变,其中GC→TA突变的发生已为大量研究所证实,并被认为是氧化应激因素致癌、致突变的主要机理之一。机体修复机制正常时,8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下从DNA链上切除并重新掺入正常的鸟嘌呤碱基,而切下的8-OHdG则可入血经尿液排出体外。8-OHdG在体内稳定存在,一旦形成不再被机体进一步代谢,尿中8-OHdG含量与细胞内DNA氧化损伤程度相关。目前机体8-OHdG水平已被广泛接受为评价DNA氧化损伤的标志物,并用来估计氧化应激相关癌症发生的危险性。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗8-OHdG抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗8-OHdG抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的8-OHdG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板:一块(96孔)
2. 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为5,000 pg/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释5,000 pg/ml,2,500 pg/ml,1,250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,156 pg/ml,78 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。
如配制2,500 pg/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)5,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液:1×20ml/瓶。
4. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。
5. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。
6. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul检测溶液A加990ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
11. 覆膜:1×5张
标本的采集及保存
1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
4. 组织匀浆:将动物的组织标本先用PBS洗涤,去除多余血液,匀浆化后放在20ml PBS中于-20℃放置过夜,第二天,经过二次反复冻融破膜,将匀浆物5000x g离心5分钟,取上清即可检测。
5. 样本处理:血清或血浆标本推荐稀释10倍,如:稀释10倍,取10ul血清或血浆加入90ul样品稀释液。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。
注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过3个月,-80℃不应超过6个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测;高血脂的标本不需进行特殊处理,可直接检测。
操作步骤
实验开始前,请提前配制好所有试剂;试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,均应用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul,余孔分别加标准品或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul,37℃,60分钟。
5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。
注:
1. 每次实验留一孔作为空白调零孔(不同于空白孔),该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。
3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜,以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板长时间处于干燥状态。
4. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
5.在储存和温育时避免强光直接照射。
6.未使用完的酶标板或者试剂,请于2
7.建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水
纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需
要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线(推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如curve expert 1.3),根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
2. 一次加样时间最好控制在5 推荐仪器