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ELISA法检测立克次体

    立克次体(Rickettsia)是一类专性活细胞内寄生的原核细胞微生物，具有细胞壁，含有RNA和DNA，以二分裂繁殖。需在细胞内繁殖，不能在无细胞的人工培养基中生长。它是属于人兽共患的自然疫源性疾病。临床上常见的有普氏立克次体、莫氏立克次体、恙虫病立克次体和Q热立克次体等，它传播的疾病主要是斑疹伤寒、恙虫病和Q热。检测血清中立克次体的特异性方法包括：免疫荧光法、ELISA、间接血凝法、乳胶凝集法和微量凝集法等。ELISA法特异性强、敏感性高、可重复性好，现已广泛应用于检测各种立克次体感染，但其缺点是需要使用纯化的抗原。本节仅对Q热立克次体抗体ELISA法进行介绍。

    [检测方法]ELISA法

    [方法学原理，  将可溶Q热立克次体吸附于固相载体上，洗去未吸附的抗原，加入待检血清使其与载体上吸附的抗体连接，洗涤后加入酶标记的抗人血清球蛋白，温育后漂洗，加底物溶液，底物降解出现呈色反应，颜色改变的程度与待检血清的含量成正比。

    [标本准备]

    取新鲜末梢血或静脉血。如采血后24h内不能进行试验，分离血清后将其保存于-20℃环境中。检测时，使样本恢复至室温。

    [试剂]

    1．0．05mol／LpH 7．4 PBS-Tween-20

    2．0．01mol／LpH 9．6碳酸盐缓冲液

    3．HRP标记抗人球蛋白血清

    4．邻苯二胺底物溶液

    5．2mol／L H2S04

    6．纯可溶性Ⅱ相Q热立克次体抗原(制备方法见微量凝集试验检测Q热立克次体抗体)

    [仪器)  酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。

    (检测步骤]

    1．用0．05mol／LpH 9．6碳酸盐缓冲液稀释抗原使成每毫升含蛋白10／1g左右，包被酶标板，每孔0．2ml，于37℃环境中2h后，于4℃环境中过夜。

    2．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，用于。

    3．被检血清经含1g／L牛血清清蛋白的PBS-Tween-20作l：200稀释，加人相应孔中，同时加2孔已知阳性对照和2孔阴性对照，放37℃环境中2h。

   4．用0．Olmol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，甩干。

    5．加酶标记抗体，每孔0．2ml，37℃环境中2h。

    6．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween-20洗3次，甩干。

    7．加底物溶液，每孔0．2ml，室温避光保存15—30min，各孔加入2mol／l H2S04 1滴终止反应，用酶标光度计490nm测每孔吸光度值(A值)。

    (正常参考值]  Q热立克次体抗体阴性

    [注意事项)

    1．可溶性抗原必须纯净，否则影响结果。

    2．每次试验应同时做2份阳性及2份阴性对照。

    3．其他注意事项同检测HBsAg的ELISA。

    [临床意义]

    1．血清诊断为Q热最常用的特异性诊断方法，其特异性很高，未发现与其他疾病有交叉反应。

2．在发病过程中，Q热抗体滴度不断增长，恢复期抗体水平高于急性期4倍以上，则对确诊Q热有重要意义。

    3．Q热现症诊断主要依据Ⅱ相抗体水平的上升。一般来说，发病1周左右血清中即有Ⅱ相补体结合抗体出现。若第1相抗体一直保持较高水平，或第1相抗体滴度高于第Ⅱ相滴度，则往往说明感染仍然存在。如患者血清Ⅱ相抗体滴度超过1：200提示为慢性Q热，特别在伴有感染性心内膜炎时更有意义。

    4．1977年，Cracea等提出，在Q热急性期Ⅱ相抗原的微量凝集试验阳性率达85．3％。

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